PCR技术及其应用(全)

（1）加入2 ml pH 7.8的饱和酚，滴管抽吸混匀。 3500~4000r/min离心5分钟。 （2）取上层水相至另一离心管，加入等体积的 氯仿：异戊醇（24：1），滴管混匀，3500~4000r / min离心5分钟。
目录
沉淀DNA 将上层水相移至另一试管中，小心加入2.5倍体 积的无水乙醇，用滴管吸取上层乙醇沿管壁缓慢冲 洗下层溶液（小心），看到DNA絮状沉淀完全析 出为止。 用吸管吸出絮状沉淀至另一离心管，70%乙醇洗 涤2次，放置于冰箱挥干。将上述挥干的DNA加入 200μl TE（或者灭菌双蒸水），轻轻震荡，使之溶 解。
整个扩增反应可在2～4小时完成。
目录
二、 PCR的体系组成
总体积 Buffer (Mg2+) dNTP Primer 50-100 l 缓冲液 原料 引物
DNA分子
Taq酶
模板
DNA聚合酶
目录
5 Essential Components of PCR Reaction
salts (ions)
4
5
目录
PCR的基本原理
DNA引物
PCR反应条件 50℃ 95℃ PCR过程 PCR的特点
引物1
引物2
目录
PCR的基本原理
Taq酶
DNA引物
PCR反应条件 72℃ 50℃ PCR过程 PCR的特点
引物1
引物2 Taq酶
目录
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
PCR反应条件 PCR过程 72℃ PCR的特点 95℃
three steps:
Denaturation (变性): 90～97℃
Annealing (退火): 45～65℃ Extension (延伸): around 72℃
目录
目录
1. Denaturation 2. Annealing 3. Extension
聚合酶链式反应
目录
PCR的基本原理
40
20
40 50 60 70 80 90 100
Saiki将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用 热变性解链DNA模板可行。
目录
(%)
温度(℃)
此酶具有以下特点：
①耐高温； ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加 新酶，便于自动化； ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长 度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此 酶的发现使PCR得以广泛应用。
目录
Semi-conservative replication
Old
new
DNA的复制 以DNA的两条链为模板，以4×dNTP为原 料，按照碱基互补配对的原则，合成子代DNA 的过程。
目录
复习
5’ 3’
解旋酶类 DNA聚合酶
dNTP
引物
体内DNA的复制
目录
体系组成
模板DNA、DDDP、dNTP、SSB 引物酶、连接酶、拓扑异构酶、解链酶
3’
解旋酶解链酶
5’
子链延长
目录
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 3’ 5‘
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC GGAUCG 引物酶
RNA引物 RNA引物
合成引物
子链延长
5 ‘ 引物酶 AUCGCG 3’
TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’ 5’
目录
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1971年，Khorana及其同事提出：经 过 DNA 变性，与合适引物杂交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该 过程便可克隆tRNA基因。
但由于测序和引物合成的困难，以 及 70 年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana等 的早期设想被人们遗忘了……
最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热， 使这一过程耗时，费力，且易出错
耐热 DNA 聚合酶的应用使得 PCR 能高效率的进行，随后 PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
目录
N端
DNA-pol Ⅰ 木瓜蛋白酶
C端
小片段
5 核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
DNA聚合酶活性
5 核酸外切酶活性
• Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。
目录
94℃
55℃
37℃
变性
退火
延伸
目录
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
5’
目录
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 3’ 5‘
5’ 3’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC DNA GGAUCG TAGCGCTATCGCATCGACGCT 聚合酶
DNA 聚合酶
合成引物
5‘
子链延长
3’
AUCGCGATAGCGTAGCTGCGAGGATCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
目录
PCR的基本原理
Taq
PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ PCR过程 Taq PCR的特点
Taq
Taq
目录
PCR的基本原理
第2轮结束
PCR反应条件 PCR过程 72℃ PCR的特点
目录
模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增

PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命名为 当年的风云分子 (Molecule of the year)
目录
94℃
55℃
72℃
PCR循环
目录
“I do my best thinking while driving”
1993 Nobel prize
目录
本章要讲述的主要内容： 一、PCR的基本原理 二、PCR的体系组成 三、PCR的实施 四、PCR的结果分析及条件优化 五、PCR的类型与应用 六、PCR的相关仪器介绍
（1）取2ml（EDTA抗凝）全血，加入等体积3%的
明胶，用滴管抽吸混匀，37℃水浴静置5-10分钟。
（2）吸取上清液，3500~4000r/min离心5分钟。
（3）弃上清液，留沉淀。
目录
破碎WBC
在留有沉淀的试管中加TES 2ml，溶解沉淀。 加10% SDS 10滴，吸管抽吸混匀，破膜。
抽提DNA
目录
Kary B. Mullis（1944－）
目录
引物
DNA聚合酶
Mullis的 构思
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
目录
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶 链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制
6
64
1,048,576 1,073,741,824
目录
7 cycle = 128 Amplicon
20 30
(2) 特异性
引物
引物
引物的序列及其与模板结合的特异性是决定 PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增 效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增
目录
(3)操作简便易行
目录
加热
变 性
加热或强酸、碱性作用 可以使 DNA双螺旋的氢 键断裂,双链解离,形成 单链DNA,这称为 DNA的 变性。
退 火
复 性
解除变性的条件后, 变 性的单链可以重新结合 起来,形成双链,其原有 的特性和活性可以恢复, 这称DNA复性, 也叫退火。
目录
DNA的变性和复性
How PCR works
单、双链DNA均可，制备RNA模板时要防止 降解。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制 剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
目录
目录
DNA提取：酚－氯仿法
组织、血液、培养细胞、质粒的提取方法有所不同
全血基因组DNA提取：
收集WBC
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
PCR反应条件 95℃ PCR过程 PCR的特点
1
2 模板DNA 3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
the double strand DNA open to single stranded DNA
Renaturation：复性
two single stranded DNA form double strand DNA
Semiconservative replication：半保留复制
replication, one make two
DNA Polymerase
Template DNA
dNTPs
Primers
目录
三、 PCR的实施
技术流程：
模板获取
PCR扩增
引物设计
结果鉴定
体系建立
体系优化
目录
（一）模板的获取 来源：病原体标本（病毒, 细菌，真菌等）
病理生理标本（ 组织，血液，尿液等） 类型：DNA模板 RNA模板
目录
模板
DNA复制的基本过程
复制的起始 复制的延伸
复制的终止
目录
复制的起始
Dna B、 Dna C Dna A 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5 3
含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。
目录
复制的起始
3
5 3
引物
5
引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
1988年Saiki 等从温 泉（ Hot spring）中分 离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
thermus aquaticus
目录
耐热DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 3 4 5 2 4 8 16 32
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
第4轮扩增 第5轮扩增
第6轮扩增
目录
After 25~30 cycles
Last Step : 72 ℃ 5-10 min
?
目录
PCR技术的特点
(1) 高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍
30轮循环
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
目录
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 Amplicon
它最大的特点就是能不断推出新形式。
——摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow]
目录
PCR技术简史
DNA 解旋解链
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
3’
合成TGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
目录
一、PCR的基本原理
The polymerase chain reaction is used to amplify a segment of DNA that lies between two regions of known sequence.
目录
The concepts of PCR
Denaturation: 变性
PCR技术及其应用
PCR: Polymerase chain reaction 聚合酶链反应，亦称DNA的体外 扩增技术。
广西医科大学生物化学与分子生物学教研室 贺菽嘉
目录
PCR ?
PCR只是一个简单的不起眼玩艺
——凯利·穆利斯（Kary Mullis)
PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念 变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术， 后者又上升成为新的概念。 …
目录
2. RNA提取：
（1）取组织100~200mg加入7ml离心管中，加PBS
缓冲液或Hanks液1ml，高速冰浴匀浆。
（2）取上述匀浆200ul至一个1.5ml的离心管中，加 TRIZOL500ul，震荡混匀，室温放置10分钟。 （3）加氯仿200ul，旋涡震荡1分钟，室温放置2~3 分钟。