pcr技术及其应用 ppt课件汇编
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PCR技术教程PPT课件
Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数。
第10页/共71页
特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
第5页/共71页
PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
第3页/共71页
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
第4页/共71页
特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
第8页/共71页
第9页/共71页
原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
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特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
第3页/共71页
循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
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特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
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原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。
PCR技术的基本原理及应用 ppt课件
11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到
两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩
增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。
对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低
浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形
成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列
的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20
和检测病理切片中含量ppt课较件 少的靶序列。
42
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适 于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
ppt课件
B.阴性对照
43
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
Prize
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
ppt课件
1
第一节 PCR的原理
Kary Mullis
research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus
co-winner of 1993 Nobel
PCR技术的原理与应用ppt课件
2
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
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锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
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2.PCR技术的主要类型及其应用
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锚定PCR原理示意图
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标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
PCR技术及其延伸与应用PPT课件
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5
PCR与病毒类疾病应用
• 杂交法检测植物病毒和类病毒 • 利用RT-PCR对黄瓜病毒源种类进行检测 • 诊断人类乳头状病毒HPV感染
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6
诊断遗传疾病
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7
PCR的特点
• 特异性高-聚合酶 • 首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的
Klenow大片段。90℃会变性失活，需每次 PCR循环都要重新加入；同时引物是在37℃ 延伸 • Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等从温泉水中 分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的， 扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很 低、其错配率一般只有约万分之一
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8
• 高度敏感：
• dNTP贮备液 • DNA模板
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11
操作程序
• 试剂混合 • PCR仪程序设计：94℃变性30s，55℃退火20s，然后
在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后， 再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
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12
PCR反应基本条件及其对PCR的影响
• 100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳， • Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的
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14
缓冲液
• 缓冲液的目的：给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应 条件。
• 目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (Tris是一种双极性离子缓冲液，pH变化于6.8-7.8之间。 将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。
PCR技术及其应用ppt课件
5’-primer: stem-loop structure with high melting temperature
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12
Primer Design: avoid failure of amplification High difference between product and primer melting temperatures.
最新版整理ppt
19
Frequently used PCR methods Real-Time PCR (quantitative PCR)
Detect fluorescence for each cycle Quantitaive by amplification curve Quanlity control
最新版整理pptmp; stages
Initialization step Denaturation step
20~40 Cycles
Annealing step
Elongation step
Final elongation
Final hold
最新版整理ppt
Exponential amplification Leveling off stage Plateau
医学分子细胞生物学研究方法
PCR技术在医学中的应用
最新版整理ppt
1
What is PCR Why do PCR How to PCR
最新版整理ppt
2
polymerase chain reaction (PCR)
Developed in 1983 by Kary Mullis
最新版整理19pp9t 3年的诺贝尔化学奖
PCR-技术及应用PPT课件
dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0～7.5， 小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏 低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物 的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓 度降低。
PCR反应的特点
②灵敏度高：过去酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射 免疫分析（RIA）其灵敏度分别为ng和pg级，而PCR检 测灵敏度可达fg级，理论上可检出一个细菌或一个真 核细胞的单拷贝基因的存在；
PCR反应的特点
③简便快速：操作试剂盒时只需将样品简单处理和加 样后即可进行扩增，许多PCR检查项目在两小时左右即 可出报告；④对样品要求低：几乎所有的临床标本都 可用于PCR扩增。
PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好， 引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引 物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板 的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
PCR技术的用途
科研使用 临床医学 法医学 农业 考古学 人类学 环境保护
个体识别与亲子鉴定 GMO
PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不 对 称 PCR 的 目 的 是 扩 增 产 生 特 异 长 度 的 单 链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。
PCR技术ppt课件
组成：50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降 低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的 活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以 使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间， 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完 全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来 对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT） 与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤： （1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合 成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引 物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链 靶DNA，最后扩增靶DNA
PCR技术的应用ppt课件
PCR技术的应用
.
1、PCR技术在分子生物学中 的应用
.
一：基因克隆
基因的克隆和分离是分子生物学和细胞生 物学研究中必不可少的手段。运用PCR技 术进行基因克隆和亚克隆比传统的方法具有 更大的优点。由于PCR可以对单拷贝的基 因放大上百万倍，产生微克(pg)级的特异 DNA片段，从而可省略从基因组DNA中克 隆某一特定基因片段所需要的DNA的酶切 步骤。
.
二：重组PCR
在分子生物学研究中常常需要将两个不同的 基因融合在一起。通过PCR反应可以比较容 易地实现这一目的。
.
三：DNA序列的测定
目前广泛采用的DNA测序方法有化学法和双脱氧 法两种，它们对模板的需要量比较大。传统的模 板制备方法是将含目的基因的DNA片段进行酶切 ，建立基因库，筛选克，并亚克隆到M13噬菌体 载体上，经噬菌体产生单链DNA。这是一项比较 复杂的工作。利用PCR方法可以比较容易地测定 位于两个引物之间的序列。
●
由于PCR技术具有高特异性、高灵敏度、
操作快速、简便、对样本要求低等特点，加之它
能与多种分子生物学技术配合使用，PCR技术日
益成为遗传病诊断、发病机理的研究等方面最有
效、最可靠的方法之一。PCR技术的出现为快速
、准确地检测人类遗传病开辟了新途径
●
.
5、PCR在骨髓移植HLA-D位点配型中的应用
● HLA—DRp位点配型方法，即PCR指纹图，该技术是的 DNA经PCR扩增HLA—DR卢区基因的高度多态区域，在 分别扩增后将供、受者产物混合，混合后进行2个PCR循 环，扩增产物经12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，照相后分析 不同个体的指纹图型。当HLA-DRfl基因相合时，其基因 产物在聚丙烯酰胺凝胶中可产生一致的带型，这种多条带 型的产生是由于各种HLA单倍体中的HLA-DRfl基因的不 同亚型以及假基因上的多态性所致。当PCR最后两个匹配 循环退火时，这些基因的单链DNA复性，DRfl基因相同 的个体形成同型双链，而不同的DRfl基因之间的不同序列 形成异型双链，因此，混合匹配可进一步证实HLA—DRfl 是否相合。
.
1、PCR技术在分子生物学中 的应用
.
一：基因克隆
基因的克隆和分离是分子生物学和细胞生 物学研究中必不可少的手段。运用PCR技 术进行基因克隆和亚克隆比传统的方法具有 更大的优点。由于PCR可以对单拷贝的基 因放大上百万倍，产生微克(pg)级的特异 DNA片段，从而可省略从基因组DNA中克 隆某一特定基因片段所需要的DNA的酶切 步骤。
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二：重组PCR
在分子生物学研究中常常需要将两个不同的 基因融合在一起。通过PCR反应可以比较容 易地实现这一目的。
.
三：DNA序列的测定
目前广泛采用的DNA测序方法有化学法和双脱氧 法两种，它们对模板的需要量比较大。传统的模 板制备方法是将含目的基因的DNA片段进行酶切 ，建立基因库，筛选克，并亚克隆到M13噬菌体 载体上，经噬菌体产生单链DNA。这是一项比较 复杂的工作。利用PCR方法可以比较容易地测定 位于两个引物之间的序列。
●
由于PCR技术具有高特异性、高灵敏度、
操作快速、简便、对样本要求低等特点，加之它
能与多种分子生物学技术配合使用，PCR技术日
益成为遗传病诊断、发病机理的研究等方面最有
效、最可靠的方法之一。PCR技术的出现为快速
、准确地检测人类遗传病开辟了新途径
●
.
5、PCR在骨髓移植HLA-D位点配型中的应用
● HLA—DRp位点配型方法，即PCR指纹图，该技术是的 DNA经PCR扩增HLA—DR卢区基因的高度多态区域，在 分别扩增后将供、受者产物混合，混合后进行2个PCR循 环，扩增产物经12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，照相后分析 不同个体的指纹图型。当HLA-DRfl基因相合时，其基因 产物在聚丙烯酰胺凝胶中可产生一致的带型，这种多条带 型的产生是由于各种HLA单倍体中的HLA-DRfl基因的不 同亚型以及假基因上的多态性所致。当PCR最后两个匹配 循环退火时，这些基因的单链DNA复性，DRfl基因相同 的个体形成同型双链，而不同的DRfl基因之间的不同序列 形成异型双链，因此，混合匹配可进一步证实HLA—DRfl 是否相合。
pcr技术ppt课件
在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下， 以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的 5’→3’方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性--退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这 种新链又可成为下次循环的模板。
2021/3/26
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
2021/3/26
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
7
模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键 环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的 脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离 细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白 酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再 用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用
2021/3/26
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
6
酶浓度：催化PCR反应约需酶量1ul(总反应体系为100ul时)， 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度：注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配 制)。如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错 配；浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结 合，使游离的Mg2+浓度降低。
12
反向PCR的不足：
①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种 合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这 种选择不能在非酶切位点切断靶DNA；
②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列， 而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这 些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多 个基因序列杂交。
2021/3/26
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
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PCR技术的原理及其应用 ppt课件
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模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键 环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的 脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离 细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白 酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再 用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用
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PCR技术的原理及其应用 ppt课件
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酶浓度：催化PCR反应约需酶量1ul(总反应体系为100ul时)， 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度：注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配 制)。如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错 配；浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结 合，使游离的Mg2+浓度降低。
12
反向PCR的不足：
①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种 合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这 种选择不能在非酶切位点切断靶DNA；
②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列， 而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这 些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多 个基因序列杂交。
PCR临床应用ppt演示课件
一般不存在于血循环中
HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM
提示HBV处于复制状态
HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好
.
22
HBV
（二） HBV-DNA与“两对半” 1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；
FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。
四 TORCH感染特点与检测
TOX : Toxoplasma gondii
RV:
CMV:
Rubella virus
Human cytomegalovirus
HSV:
Herpes simplex virus
.
51
TORCH
TORCH感染特点
1. 母-胎传播的主要病原体 2. 引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因 3. 自然状态下呈隐性感染 4. 怀孕、多次输血、AIDS等易发生显性感染 5. 可致多发性、全身性感染 6. 只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防
3. 发病趋势： a. 男性多于女性。 b. 城市走向农村， c. 高收入阶层向低收入阶层扩展
4. 人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。
5. 如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎
. 32
CT
沙眼衣原体感染与致病
1. 严格的细胞内寄生。 2. 不仅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原体。 3. 近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害 性已超过淋球菌而居STD之首。
TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia
MP：Mycoplasmal pneumonia
HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM
提示HBV处于复制状态
HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好
.
22
HBV
（二） HBV-DNA与“两对半” 1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；
FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。
四 TORCH感染特点与检测
TOX : Toxoplasma gondii
RV:
CMV:
Rubella virus
Human cytomegalovirus
HSV:
Herpes simplex virus
.
51
TORCH
TORCH感染特点
1. 母-胎传播的主要病原体 2. 引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因 3. 自然状态下呈隐性感染 4. 怀孕、多次输血、AIDS等易发生显性感染 5. 可致多发性、全身性感染 6. 只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防
3. 发病趋势： a. 男性多于女性。 b. 城市走向农村， c. 高收入阶层向低收入阶层扩展
4. 人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。
5. 如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎
. 32
CT
沙眼衣原体感染与致病
1. 严格的细胞内寄生。 2. 不仅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原体。 3. 近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害 性已超过淋球菌而居STD之首。
TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia
MP：Mycoplasmal pneumonia
《PCR技术及应用》PPT课件
•引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)
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Excitation
SYBR-Green I
5’
SG SG
3’
Emission
SG
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3’
SG
5’
SG
50
SYBR-Green I
DNA
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
(%)
PCR技术的原理
1 PCR技术的基本原理
无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单 核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶 段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区 段的DNA带。
Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程(2)
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术的基本过程(3)
3 PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制 剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳 法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板 序列。
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Excitation
SYBR-Green I
5’
SG SG
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Emission
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3’
SG
5’
SG
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SYBR-Green I
DNA
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
(%)
PCR技术的原理
1 PCR技术的基本原理
无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单 核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶 段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区 段的DNA带。
Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程(2)
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术的基本过程(3)
3 PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制 剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳 法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板 序列。
PCR技术PPT课件
一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
.
28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
.
28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):
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第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理 • Ta•q
PPCCRR反过应程条件957502℃
• PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
• PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
PCR的基本原理
•第3P轮CR反扩应增条件
• PCR过程 • PCR的特点
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件95℃
• PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
形 成 2 条变 单性 链
DNA
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
3’
5’
5’
3’
限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记
PCR反应条件
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR）
• 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制
• 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1971年，Khorana提出：经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。
• 但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
DNA ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
3’TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
• 对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA
引物设计：
（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源
序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
1.5mmol/L
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
形 成 2 条变 单性 链
DNA
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上12 Nhomakorabea3
周俊宜 基础医学院生化教研室
目录
PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件5702℃
• PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件7925℃
• PCR的特点
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
5’
DNA ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
RNA引物
合成引物
RNA引物
5引‘A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。
生物样品 DNA片段
基 基 基 法人 因 因 因 医类 诊 治 工 学学 断 疗 程 检研
产 测究 品
……
基因组DNA
获取特定DNA片段 扩 增 特 定 片 段
第4轮扩增 第5轮扩增
第6轮扩增
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
• 灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
• 简便、快速
DNA
DNA聚合酶
引物
引物
引物 DNA聚合酶
Sanger的
测序技术
M13噬菌体
Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
• 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪
• 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
40
20
40 50 60 70 80 90
100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u