PCR技术的原理及应用ppt

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PCR技术的基本原理及应用 ppt课件

11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到
两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩
增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。
对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低
浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形
成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列
的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20
和检测病理切片中含量ppt课较件少的靶序列。
42
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
ppt课件
B.阴性对照
43
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
Prize
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
ppt课件
1
第一节 PCR的原理
Kary Mullis
research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus
co-winner of 1993 Nobel

pcr培训ppt课件

实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深入，对PCR技术的灵敏度和特异性提出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异性，以满足更广泛的研究和应用需求。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准确地获取特定基因片段，为基因克隆提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同条件下的表达水平，有助于理解基因功能和调控机制。

PCR技术的原理与应用ppt课件

2
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ：锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA，并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物，另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
9
2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等。

pcr技术PPT课件

课题2
多聚酶链式反应（PCR)扩增 DNA片段
温故知新1
• 组成DNA分子的基本单位是什么? • 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? • DNA分子结构有什么特点？
脱氧磷酸
脱氧
核苷
核糖脱氧核苷
腺嘌呤（A）嘌呤
酸
含氮
鸟嘌呤（G）
碱基嘧啶胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
5 4
3
1 2
OH HO P O
弹体
三种炸药：
普通炸药
小型
普通炸药
爆炸
铀235 外壳
原
子Ｕ235 裂变
弹
氘、氚、重氢化钾等
氘、氚聚变
引爆装置
2 1
H
3 1
H
4 2
He
01 n
氢弹爆炸形成的磨姑云
三、受控热核反应——核聚变的利用
可控热核反应将为人类提供巨大的能源,和平利用聚变产生的核量是非常吸引人的重大课题，我国的可控核聚变装置“中国环流器1号”已取得不少研究成果.
2、铀核的裂变
（1）发现
1939年12月，德国物理学家哈恩和他的助手斯特拉斯曼发现，用中子轰击铀核时，铀核发生了裂变。
（2）裂变产物多种多样
235 92
U+
1 0
n
→15464
Ba
+
89 36
Kr
+310
n
235 92
U+
1 0
n
→15461Ba
+
92 36
Kr
+310
n
请计算铀裂变时释放的能量已知铀核裂变的反应：
热核反应和裂变反应相比较，具有许多优越性。

定量PCR基本原理及方法-PPT精品文档

原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数) 2. 实时检测法定量原理前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）
成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：
LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)
Ampliflour Probe，LUX
定量分析
基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman
根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon LC Green
利用扩增信号的种类来分型双Taqman探针法检测野生型和突变型
在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效地扩增出来，则样本为杂合型。
后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB
荧光定量PCR的定量原理
PCR的理论方程： Y=x×(1+ Ev)n Real-time Chemistries
Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数
1. 终点法定量原理
前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同
定量PCR基本原理及方法
基因有限公司黄妤
内容
一．荧光定量PCR基本原理二．荧光定量PCR标记方法三．荧光定量PCR不同方法学的应用
一．荧光定量PCR基本原理

PCR的原理与应用课件

加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
*
cDNA序列的克隆
.
*
（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
.
*
EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖, Mullis是其中之一
.
*
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
.
*

PCR检测技术ppt课件

.
变性
延伸
退火
上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25~40个循环后DNA可
.
三、PCR的基本操作 PCR技术路线/流程
反应体系的配制
标本的制备
反应条件的选择与优化
扩增产物的分析
.
PCR实验室
505 试剂配制室； 506 标本处理室； 507 扩增室； 508 扩增产物分析室。
AT
GC AT
亲代DNA
AT
CG
TA
TA
AT
AT
GC
GC
AT AT
子代DNA
AT AT
CG
CG
TA
TA
TA
TA
.
半保留复制
.
2、三个基本的步骤循环
①变性加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成
两条单链。 ② 退火
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。 ③ 延伸
开离心管时动作要轻，以防管内液体溅出。
感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
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1、在本区的实验操作，必须戴手套并经常更换。 2、为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 3、对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 4、样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。
.
核酸提取方法

PCR技术原理与操作PPT

PCR步骤
PCR技术进行时的实验步骤及关键点。
1 准备反应体系
准确配制反应体系，对反应结果有决定性的影响。
2 初始变性
94℃高温变性DNA，断与模板DNA结合，为复制DNA段提供模板。
中温度下，聚合酶按照引物模板，从5' 到 3' 延长新DNA链。
PCR反应体系与条件
PCR反应体系和条件对PCR反应质量的影响及优化方法。
反应体系
PCR反应液的主要成分是DNA模板、引物、酶和缓冲剂等。
反应条件
包括温度、时间、酶的用量，不同反应条件对反应结果有着明显的影响。
优化方法
PCR后期的处理包括电泳分析、测序等，也是PCR发现和应用的重要方面。
PCR应用领域
PCR技术最新的应用案例及特点和优势。
1
鉴定GMO
利用PCR技术提供检测和确定转基因技术应用在食品中的程度和情况。
2
疫情监测
PCR技术在病原体检测、疫情监测等方面有广泛应用。
3
医学诊断
PCR技术已成为临床医学检测中最敏感的检测技术之一，成为诸多疾病的确诊手段。
PCR技术发展和创新
PCR技术的发展历程及当今应用的新技术和新方法。
蓝光PCR技术
利用DNA和RNA在紫外光和蓝光照射下的发光原理进行检测。
实时荧光定量PCR技术
将定量PCR与荧光检测技术相结合，能够准确快速地检测样本中的目标序列。
数字PCR技术
将PCR反应分隔为大量微小空间进行，可有效减少标准曲线算法的误差和PCR非特异性增长的影响。
PCR技术的优缺点和局限性
无处不在
在病毒、遗传疾病的诊断和育种等领域都有广泛应用。

PCR技术ppt课件

组成：50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
（六）PCR反应标准体系
五、PCR的反应条件控制
（一）PCR反应的温度和时间控制
1、变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最
主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
AFLP
兼并引物PCR
巢氏PC
免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCR
MSP甲基化特异 PCR
（一）温度梯度PCR
1、概念：通过对复性温度比引物的Tm值低2-
10℃的范围内进行系列PCR预实验来对复性条件进行优化.
温度梯度PCR
Thermal Image of 45-65°C Gradient
联合逆转录反应（reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于 10个拷贝的RNA模板。 2、RNA扩增包括两个步骤：（1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA （2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA

pcr技术ppt课件

在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的合作者Michael Smith在《科学》杂志上首次公开描述了PCR方法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后

FQPCR技术的原理及应用ppt课件

火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去
Producer
•
•
•
•
•
Roche
ABI
Thermo
Stratgene
Biorad
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去
平台PCR仪介绍
ABI 7500 fast
特征：
使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直
观
ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差
（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光
性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性
（如孔间、批间温度的波动）
Rn= Normalization = Reporter / Referenc
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去
2、TaqMan探针法
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TaqMan作用机理
软件操作简单
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• StepOneTM
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PCR技术的原理及应用ppt课件

22
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
• PCR的特点
第2轮结束
23
模板DNA
第1轮扩增第2轮扩增
• PCR反应条件
• 第PC3R轮过程扩增
• PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
24
提纲
实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用
PCR技术的原理及应用
1
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
2
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
（℃）
55
22
DNA 2
形成

子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
18
PCR的基本原理
DNA引物
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
引物2
19
PCR的基本原理
• •
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘

荧光定量PCR的原理及其应用PPT课件

操作复杂
荧光定量PCR的操作过程相对复杂，需要专业人员进行操作。
荧光染料和探针的干扰
荧光染料和探针有时会对PCR扩增产生干扰，影响结果的准确性。
样本中存在抑制剂的可能性
某些样本中可能存在PCR抑制剂，影响荧光定量PCR的检测结果。
05 荧光定量PCR的发展前景
技术改进与优化
01
02
03
高效多重检测
合成新的DNA链。
的DNA链结合，产生荧
光信号，通过检测荧光
信号的积累，可以实时
监测DNA的扩增过程。
02 荧光定量PCR的种类
SYBR Green I法
原理
SYBR Green I是一种荧光染料，可以与双链DNA结合并发出荧光信号。在PCR扩增过程中，随着DNA的合成，SYBR Green I荧光信号会逐渐增强，通过监测荧光信号的增强程度可以实时监测DNA的合成。
通过荧光定量PCR技术，可以检测肿瘤组织中特定基因的表达水平，从而评估肿瘤的恶性程度、转移风险和预后情况。
在传染性疾病诊断中的应用
传染性疾病的病原微生物种类繁多，荧光定量PCR技术可以用于快速检测和鉴定病原微生物，为传染性疾病的诊断提供准确依据。
通过荧光定量PCR技术，可以检测出病原微生物的核酸序列，从而确定传染性疾病的病原体类型、感染部位和传播途径。
结合微流体技术和数字 PCR技术，实现单分子检测，提高检测的灵敏度和分辨率。
纳米材料增强
利用纳米材料增强荧光信号，降低背景噪声，提高检测的信噪比。
基因编辑技术
结合基因编辑技术，对基因组进行定点编辑和改造，为疾病治疗和基因治疗提供新手段。
未来发展方向与展望
临床应用拓展

PCR技术的原理及其应用ppt课件

③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的 5’→3’方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性--退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
PCR反应五要素：
即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
多重PCR的用途主要有两方面：
1.多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。
2.病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个突变部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等。
合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒 DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原。
免疫PCR优点为：
①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上；
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其特异性和敏感性高于一般的PCR 。

PCR原理ppt课件

1. 长片段DNA的PCR扩增常规PCR长度为2kb以下。长片段PCR扩增存在的问题：（1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低（2）高温会损坏模板DNA和PCR产物（3）高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解（4）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合
酶与模板DNA的趋近和接合变得困难（5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发
4）PCR 反应液的配制最后加入 DNA 聚合酶。
早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。
5、反应体系
总体积
50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
⑤DNA聚合酶：最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
6.PCR技术的特点 1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环
2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ）
使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR 扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个 PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性 DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)

PCR技术PPT课件

一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法：一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
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四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。
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10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
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扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):