PCR技术及其应用ppt课件

DNA 2
形 成
条变 单性 链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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二、PCR反应体系
缓冲液 dNTP 引物 模版 DNA聚合酶
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1. 缓冲液
标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl
pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下， pH 值接近 7.2
缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+ ，有 时使用 Mn2+
缓冲液中还含有 50mM 的钾离子
有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降 低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。
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③引物的延伸： DNA模板--引物 结合物在 TaqDNA聚合酶 的作用下，以 dNTP为反应原 料，靶序列为模 板，按碱基配对 与半保留复制原 理，合成一条新 的与模板DNA 链。
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End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence
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Target Amplification
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
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Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量 下降； Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。 Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异 性和产率
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70 80 90 100
温度p(pt℃课件).
6
94℃
55℃
72℃
PCR循环
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Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
sequences
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后， 温度降至55℃左右，引物与模板DNppAt课单件. 链的互补序列配对结合1；3
PCR Cycle - Step 3 -
At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
每完成一 个循环需 2～4分钟， 2～3小时 就能将待 扩目的基 因扩增放 大几百万 倍。
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模板DNA
第1轮扩增 第PC2R反轮应扩条增件
PCR过程
第PC3R的轮特扩点增
PCR的基本原理
理想拷贝数=2n
重n 循复环次数30轮后
第4轮扩增第5轮2扩3增0=1,0第763轮,扩增741,824 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科 学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
“我不大喜欢动手,我宁肯不动手,我不喜欢做费力的事。作为
一个发明家,重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简
捷的动手方案。”这是PCR的发明者Mullis在1991年对《研究
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② 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现
Mullis的构思
引物 DNA聚合酶
DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
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3
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
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4
94℃
55℃
37℃
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5
③ 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术
7 cycle = 128 Amplicon
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No. of Cycles
1
No. Amplicon Copies of Target
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
17
PCR反应
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
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第八章 PCR技术及其应用
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1
PCR技术的建立
①Khorana(1971)等提出在体外经
DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设 想—“修复复制”
但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
与发展》杂志(R&D)记者说的一番ppt课话件.
8
第八章 PCR技术及其应用
第一节 PCR技术原理和 工作方式
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一、PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制
首先待扩增DNA•模板加热变性解链，随之将 反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引 物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退 火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成 为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
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PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target
这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循 环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断 重复。
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PCR原理示意图
PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)
Target Sequence