PCR技术的原理及应用ppt课件
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PCR的基本原理和应用 PPT课件
PCR 的 基 本 原 理 和 应 用
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
PCR技术的基本原理及应用 ppt课件
11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到
两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩
增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。
对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低
浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形
成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列
的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20
和检测病理切片中含量ppt课较件 少的靶序列。
42
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适 于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
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B.阴性对照
43
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
Prize
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2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
ppt课件
1
第一节 PCR的原理
Kary Mullis
research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus
co-winner of 1993 Nobel
PCR的原理和操作过程ppt课件
PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1第一轮2 扩增3
4
5
时间（min）
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6
退 火 PCR的基本原理
3扩增 在PCR仪上设置PCR反应参数（具体数据根
据引物和扩增片段的大小而定）：94℃下加热4分钟左右 ；依次94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟 ，循环32次左右；72℃下保温7分钟，使反应产物扩增充 分
4PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增，
其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能 得出正确的结论。ＰＣＲ产物的分析，可依据研究对象和 目的不同而采用不同的分析方法
PCR过程 PCR的特点
第4轮扩增
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12
PCR的特点
PCR 的特点
• 灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
1. 简便、快速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
2. 对标本的纯度要求低
1. 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA
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PCR技术的原理及其应用ppt课件
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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9
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了 具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜 力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
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3
1.PCR技术的基本原理
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：即在高温（93℃左右）下，待扩增的靶 DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；
②模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（37～55℃）情况 下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补 序列配对结合；
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14
锚定PCR原理示意图
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标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利用 同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测靶 基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR， CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧光染料标 记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物 5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光 的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检 测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的 型别鉴定等。
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16
不对称PCR：
不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物， PCR扩增后产生大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制 引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。在PCR反应 的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当 限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引 物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键 是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比 例。还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链 DNA，然后以此双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行 第二次PCR，制备单链DNA。不对称PCR制备的单链DNA， 主要用于核酸序列测定。
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2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了 具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜 力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
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1.PCR技术的基本原理
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：即在高温（93℃左右）下，待扩增的靶 DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；
②模板DNA与引物的退火(复性)：在低温（37～55℃）情况 下，两条人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补 序列配对结合；
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锚定PCR原理示意图
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标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利用 同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测靶 基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR， CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧光染料标 记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物 5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光 的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检 测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的 型别鉴定等。
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不对称PCR：
不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物， PCR扩增后产生大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制 引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。在PCR反应 的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当 限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引 物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键 是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比 例。还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链 DNA，然后以此双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行 第二次PCR，制备单链DNA。不对称PCR制备的单链DNA， 主要用于核酸序列测定。
PCR技术ppt课件
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度， 还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引 物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温 度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度（特别是开始的 阶段）可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反 应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板 之间完全结合。
加入10dmso有利于减少dna的二级结构使gc含量高的模板易于完全变性在反应体系中加入dmso使pcr产物直接测序更易进行但超过过10时会抑制taqdna聚合酶的活性降低保真性因此大多数并不使用dmso
第六章 PCR技术
一、PCR的原理
PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于
（5）二甲基亚砜（DMSO）：加入10%DMSO有利于减少
DNA的二级结构，使（G+C）%含量高的模板易于完全变性， 在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行，但超 过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性、降低保真性 ，因此， 大多数并不使用DMSO。
4、退火(复性)温度与时间：
退火温度是影响PCR特异性的重要因素。变性后温度快速 冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模 板互补链之间的碰撞。
决定最低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成， 例如，在100μl反应体系中，4×dNTPs浓度若用20μmol/L， 基本满足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L 的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成 25μg/DNA。
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度（特别是开始的 阶段）可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反 应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板 之间完全结合。
加入10dmso有利于减少dna的二级结构使gc含量高的模板易于完全变性在反应体系中加入dmso使pcr产物直接测序更易进行但超过过10时会抑制taqdna聚合酶的活性降低保真性因此大多数并不使用dmso
第六章 PCR技术
一、PCR的原理
PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于
（5）二甲基亚砜（DMSO）：加入10%DMSO有利于减少
DNA的二级结构，使（G+C）%含量高的模板易于完全变性， 在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行，但超 过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性、降低保真性 ，因此， 大多数并不使用DMSO。
4、退火(复性)温度与时间：
退火温度是影响PCR特异性的重要因素。变性后温度快速 冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模 板互补链之间的碰撞。
决定最低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成， 例如，在100μl反应体系中，4×dNTPs浓度若用20μmol/L， 基本满足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L 的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成 25μg/DNA。
《PCR详细讲解》课件
Oligo
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
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Primer BLAST
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
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逆转录PCR
《PCR详细讲解》
逆转录PCR的原理
由一条RNA单链转录为互补DNA （cDNA）称作逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR），由依 赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完 成。
《PCR详细讲解》
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
《PCR详细讲解》
24个核苷酸。 识别mRNA的3’端poly（A）尾，
因此仅mRNA可被逆转录。
《PCR详细讲解》
逆转录引物：
（3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡
核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
《PCR详细讲解》
半定量 RT-PCR
《PCR详细讲解》
基本概念
半定量RT-PCR（semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特 异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增， 并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
pcr培训课件ppt
遵循标准化操作流程，确保实验 的一致性和准确性。
数据分析
对实验数据进行统计分析，识别 并排除异常值。
质量控制标准
制定质量控制标准，对实验结果 进行评估和监测。
04
PCR技术发展与展望
PCR技术的改进与创新
1 2
优化反应体系
通过调整反应成分和条件，提高PCR的特异性和 灵敏度，降低背景噪音。
新型PCR技术的开发
PCR技术的原理
双链DNA加热变性
在高温下，双链DNA解旋为单链 DNA。
引物与单链DNA结合
根据已知序列设计特异性引物， 在低温下与单链DNA结合。
DNA聚合酶催化延伸
在适宜温度下，耐高温的DNA聚 合酶催化引物沿着单链DNA延伸
，合成互补链。
重复加热变性、退火和延伸
反复进行变性、退火和延伸，实 现DNA片段的指数级扩增。
产物检测与鉴定
电泳检测
可以使用琼脂糖凝胶电泳 或聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测PCR产物。
荧光检测
可以使用荧光染料或探针 检测PCR产物。
测序鉴定
如果需要，可以对PCR产 物进行测序，以确定其序 列是否与预期一致。
03
PCR实验注意事项
实验安全
实验室安全须知
确保实验室内环境整洁，避免交 叉污染。
个人防护措施
THANKS
食品安全检测
利用PCR技术检测食品中的微生物、毒素和污染 物，保障食品安全。
PCR技术的研究方向
提高灵敏度和特异性
进一步优化PCR技术，提高检测的灵敏度和特异性，降低假阳性 或假阴性的可能性。
标准化和质量控制
建立PCR技术的标准化和质量控制体系，确保实验结果的可靠性和 可比性。
数据分析
对实验数据进行统计分析，识别 并排除异常值。
质量控制标准
制定质量控制标准，对实验结果 进行评估和监测。
04
PCR技术发展与展望
PCR技术的改进与创新
1 2
优化反应体系
通过调整反应成分和条件，提高PCR的特异性和 灵敏度，降低背景噪音。
新型PCR技术的开发
PCR技术的原理
双链DNA加热变性
在高温下，双链DNA解旋为单链 DNA。
引物与单链DNA结合
根据已知序列设计特异性引物， 在低温下与单链DNA结合。
DNA聚合酶催化延伸
在适宜温度下，耐高温的DNA聚 合酶催化引物沿着单链DNA延伸
，合成互补链。
重复加热变性、退火和延伸
反复进行变性、退火和延伸，实 现DNA片段的指数级扩增。
产物检测与鉴定
电泳检测
可以使用琼脂糖凝胶电泳 或聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测PCR产物。
荧光检测
可以使用荧光染料或探针 检测PCR产物。
测序鉴定
如果需要，可以对PCR产 物进行测序，以确定其序 列是否与预期一致。
03
PCR实验注意事项
实验安全
实验室安全须知
确保实验室内环境整洁，避免交 叉污染。
个人防护措施
THANKS
食品安全检测
利用PCR技术检测食品中的微生物、毒素和污染 物，保障食品安全。
PCR技术的研究方向
提高灵敏度和特异性
进一步优化PCR技术，提高检测的灵敏度和特异性，降低假阳性 或假阴性的可能性。
标准化和质量控制
建立PCR技术的标准化和质量控制体系，确保实验结果的可靠性和 可比性。
PCR技术的原理与应用ppt课件
2
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
13
锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
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2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
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锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
8
Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
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2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
PCR的原理与应用课件
加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
*
cDNA序列的克隆
.
*
（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
.
*
EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
.
*
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
.
*
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
*
cDNA序列的克隆
.
*
（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
.
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EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
.
*
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
.
*
PCR技术原理及其应用ppt课件
（4）循环次数 主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次
次数过多：非特异扩增增加
38
（三）PCR产物的积累规律
在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学 原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的 DNA产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢进入相对 稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到 达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、 PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产 物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般 要进行25次以上PCR循环。
PCR技术原理及其应用
§1 PCR技术原理 §2 PCR技术应用
第一节 PCR技术原理
2
一、PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
合成引物
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
39
PCR产物的积累规律示意图
40
五、PCR引物的设计
（一）一般原则
①引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特 异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合 成引物的成本增加。
②引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的 嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在 45～55％左右。
41
③避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以 免形成二聚体。
④引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变 性。
42
⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任 何二级结构的可能。 ⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产 物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。 ⑦引物与非扩增序列的同源性不应超过70％。
次数过多：非特异扩增增加
38
（三）PCR产物的积累规律
在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学 原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的 DNA产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢进入相对 稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到 达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、 PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产 物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般 要进行25次以上PCR循环。
PCR技术原理及其应用
§1 PCR技术原理 §2 PCR技术应用
第一节 PCR技术原理
2
一、PCR技术简史
• DNA的复制 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
合成引物
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。
39
PCR产物的积累规律示意图
40
五、PCR引物的设计
（一）一般原则
①引物长度在15～30碱基。引物过短，会使特 异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合 成引物的成本增加。
②引物中碱基的分布是随机的，避免4个以上的 嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C含量宜在 45～55％左右。
41
③避免两引物间的互补，特别是3‘端互补，以 免形成二聚体。
④引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列， 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变 性。
42
⑤引物的3’端不能有任何修饰，也不能有形成任 何二级结构的可能。 ⑥引物的5’端限定着PCR产物的长度，可根据产 物的要求不同， 可以选用不同的引物修饰法。 ⑦引物与非扩增序列的同源性不应超过70％。
PCR-技术及应用PPT课件
dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0～7.5， 小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏 低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物 的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓 度降低。
PCR反应的特点
②灵敏度高：过去酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射 免疫分析（RIA）其灵敏度分别为ng和pg级，而PCR检 测灵敏度可达fg级，理论上可检出一个细菌或一个真 核细胞的单拷贝基因的存在；
PCR反应的特点
③简便快速：操作试剂盒时只需将样品简单处理和加 样后即可进行扩增，许多PCR检查项目在两小时左右即 可出报告；④对样品要求低：几乎所有的临床标本都 可用于PCR扩增。
PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好， 引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引 物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板 的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
PCR技术的用途
科研使用 临床医学 法医学 农业 考古学 人类学 环境保护
个体识别与亲子鉴定 GMO
PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不 对 称 PCR 的 目 的 是 扩 增 产 生 特 异 长 度 的 单 链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。
pcr技术ppt课件
在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
《PCR技术及应用》PPT课件
•引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)
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Excitation
SYBR-Green I
5’
SG SG
3’
Emission
SG
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3’
SG
5’
SG
50
SYBR-Green I
DNA
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
(%)
PCR技术的原理
1 PCR技术的基本原理
无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单 核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶 段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区 段的DNA带。
Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程(2)
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术的基本过程(3)
3 PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制 剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳 法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板 序列。
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Excitation
SYBR-Green I
5’
SG SG
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Emission
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3’
SG
5’
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SYBR-Green I
DNA
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
(%)
PCR技术的原理
1 PCR技术的基本原理
无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单 核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶 段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区 段的DNA带。
Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程(2)
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术的基本过程(3)
3 PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制 剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳 法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板 序列。
PCR技术原理简介 PPT
基本原理
变性(denaturation):通过加热使DNA双螺旋氢
键断裂，双链解离成单链DNA 模板
模板
基本原理
退火（annealing）:当温度降低时由于模板分子结
构较引物复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于 模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而 模板DNA双链之间互补的机会较少
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR流程
PCR完成后，取1-2ul性琼脂糖凝胶电泳检测，理想结果是 目的基因扩增条带单一，片段长度与预期相符合，条带清 晰。
2、在临床医学上的应用
①病原体诊断：利用PCR可以检测标本中的各种病毒、 细菌、真菌、支原体、螺旋体、寄生虫等病原体；标 本可以是组织、细胞、血液、排泄物等。
反应体系
引物设计的原则：
引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不 佳， G+C 过多易出现非特异条带。四种碱基分布最好 是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。 Tm值最好接近72℃：以使复性条件最佳。Tm一般低于有 效启动温度5~10℃，也可按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计 Tm值。 碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其 是3’端不应超过3个连续的G或C。 4. 引物自身不能有连续4个碱基互补，否则引物自身会折 叠成发夹结构影响引物本身复性。
10-25mmol/L
Tris-HCl
KCl 50mmol/L
1.5mmol/L
MgCl2
明胶或牛血清白蛋白
100ug/ml
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～ 2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高反应特异性降低，出现非特 异扩增； 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应
PCR技术的原理及其应用ppt课件
③引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下， 以dNTP为原料，按碱基配对与半保留复制原理，从引物的 5’→3’方向延伸，合成DNA新链。重复循环变性--退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这 种新链又可成为下次循环的模板。
PCR反应五要素：
即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模 板和Mg2+。
多重PCR的用途主要有两方面：
1.多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应 管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩 增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体 感染。
2.病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原 微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失 存在多个突变部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其 型别及突变等。
合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒 DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之 处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中 形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来 判断是否存在特异性抗原。
免疫PCR优点为：
①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础 上；
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了 具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜 力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
PCR反应五要素：
即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模 板和Mg2+。
多重PCR的用途主要有两方面：
1.多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应 管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩 增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体 感染。
2.病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原 微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失 存在多个突变部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其 型别及突变等。
合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒 DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之 处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中 形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来 判断是否存在特异性抗原。
免疫PCR优点为：
①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础 上；
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了 具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜 力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
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条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件95℃
• PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70 80 90
100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u
1.5mmol/L
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
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时间（min）
PCR的基本原理
DNA引物
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
引物2
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件5702℃
如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
实时荧光定量PCR 原理 -------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件 扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值
• PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
• PCR反应条件
• 第PC3R轮过程扩增
• PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR 原理
常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。
无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检 测。
实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中 每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲 线的分析对起始模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR 原理
• PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件7925℃
• PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理 • Taq•
PPCCRR反过应程条件957502℃
• PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1971 年 ， Khorana 提 出 ： 经 过 DNA 变 性 ， 与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引 物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及 70年代基因工程技术的发明使克隆基 因成为可能，所以，Khorana的设想被 人们遗忘了……
PCR技术的原理及应用
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
3’TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
基 基 基 法人 因 因 因 医类 诊 治 工 学学 断 疗 程 检研
产 测究 品
……
基因组DNA
获取特定DNA片段 扩 增 特 定 片 段
DNA
DNA聚合酶
引物
引物
引物 DNA聚合酶
Sanger的
测序技术
M13噬菌体
Mullis 的构思
引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
94℃变性
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十 余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸 年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
生物样品 DNA片段
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚 合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐 热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随 后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
DNA 5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
ห้องสมุดไป่ตู้
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
合成引物
RNA引物
RNA引物
5引‘A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明