魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展

理化性质和生物学特性
α毒素是由 毒素是由370个氨基酸组成的单链多肽 分子量 个氨基酸组成的单链多肽,分子量 毒素是由 个氨基酸组成的单链多肽 为43 ku。它是一种依赖于锌离子的多功能性金 。 属酶,具有细胞毒性 溶血活性、致死性、 具有细胞毒性、 属酶 具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏 死性、 死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性 当把α毒素加热至 毒素加热至60~70℃时,就可以使其失去 当把 毒素加热至 ℃ 就可以使其失去 活性,当进一步加热到 当进一步加热到100℃时,又可以恢复部分 活性 当进一步加热到 ℃ 又可以恢复部分 活性
疫苗现状
梭菌类的疫苗有单价苗和多联苗， 梭菌类的疫苗有单价苗和多联苗，单价疫苗在实 际应用中难以取得很好的效果， 际应用中难以取得很好的效果，原因是致病的梭 菌种类较多，而且有的是混合感染，单价苗往往 菌种类较多，而且有的是混合感染， 是顾此失彼，不能有效地预防疾病。 是顾此失彼，不能有效地预防疾病。 国外相继出现了包括产气荚膜梭菌的四联、五联、 国外相继出现了包括产气荚膜梭菌的四联、五联、 七联和八联苗梭菌苗，不仅把梭菌苗联合起来， 七联和八联苗梭菌苗，不仅把梭菌苗联合起来， 而且还把所梭菌苗与需氧菌苗(如巴氏杆菌苗、沙 而且还把所梭菌苗与需氧菌苗 如巴氏杆菌苗、 如巴氏杆菌苗 门氏杆菌苗)联合起来 甚至与病毒苗(如羊痘疫 联合起来， 门氏杆菌苗 联合起来，甚至与病毒苗 如羊痘疫 联合起来进行防疫。 苗)联合起来进行防疫。 联合起来进行防疫
fermentation） ）
分型及其依据
根据此菌产生外毒素的种类，可将其分为A 根据此菌产生外毒素的种类，可将其分为A、B、 5个型 C、D和E 5个型 型菌： A型菌：α 型菌： B型菌：αβε 型菌： C型菌：αβ 型菌： D型菌：αε E型：αι
魏氏梭菌与相应疾病
其中， 型菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒 型菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒， 其中，A型菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒， 也可引起动物的气性坏疽， 绵羊、 也可引起动物的气性坏疽，牛、绵羊、家兔肠毒 血症 B型菌主要引起羔羊痢疾； 型菌主要引起羔羊痢疾； 型菌主要引起羔羊痢疾 C型菌主要是牛、猪肠毒血症、羊猝狙 型菌主要是牛、 型菌主要是牛 猪肠毒血症、 D型菌引起羔羊、绵羊、山羊、牛以及灰鼠的肠 型菌引起羔羊、绵羊、山羊、 型菌引起羔羊 毒血症； 毒血症； E型菌可致犊牛、羔羊肠毒血症，但很少发生。 型菌可致犊牛、 型菌可致犊牛 羔羊肠毒血症，但很少发生。
培养特性
血平板： 血平板：双层溶血环
内环完全溶血内环完全溶血-θ毒素 外环不完全溶血- α毒素 外环不完全溶血-
蛋黄琼脂平板：Nagler反应 蛋黄琼脂平板：Nagler反应 庖肉培养基：数小时即可见到生长， 庖肉培养基：数小时即可见到生长，产生 大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色， 大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色，但 不被消化 培养基： 汹涌发酵” 牛乳培养基：“汹涌发酵”（stormy
分离诊断
气性坏疽发病急剧，后果严重，需要尽早准确的做出微生 气性坏疽发病急剧，后果严重， 物学诊断，争取早期治疗： 物学诊断，争取早期治疗： 标本 镜检：可发现 大杆菌， 镜检：可发现G＋大杆菌，并伴有其他杂菌和少量形态 不规则的白细胞。 不规则的白细胞。 培养基 厌氧培养 牛乳培养基 生化反应： 生化反应：TSC 动物实验： 动物实验：泡沫肝实验 进一步鉴定: 进一步鉴定:
疫苗现状
上世纪70年代到 年代 中监所的文希喆、王泰健、 上世纪 年代到80年代，中监所的文希喆、王泰健、屠 年代到 年代， 伟英等科研人员， 伟英等科研人员，在国际上率先开创了梭菌多联干粉苗的 研究，取得满意效果，保存期长，使用方便， 研究，取得满意效果，保存期长，使用方便，可以随意搭 疫苗的保护期也得到的延长， 配，疫苗的保护期也得到的延长，基本克服了液体苗的缺 陷。 效力检验：多联苗所含的成份越多，需要的动物也越多， 效力检验：多联苗所含的成份越多，需要的动物也越多， 以致于达到不便检验的程度，严重阻碍了多联苗的发展， 以致于达到不便检验的程度，严重阻碍了多联苗的发展， 采用免疫动物测定血清中和效价的方法， 采用免疫动物测定血清中和效价的方法，来评价梭菌苗的 效力。其方法是用梭菌苗免疫动物两次后， 效力。其方法是用梭菌苗免疫动物两次后，用国际单位 (I.U.)衡量血清的中和效价，检验每批疫苗所需试验动 衡量血清的中和效价， 衡量血清的中和效价 物为8-12只。 物为 只
α毒素基因的克隆与表达 毒素基因的克隆与表达
α毒素基因在禽类和哺乳动物中都是保守的 毒素基因在禽类和哺乳动物中都是保守的 毒素的启动子是最强的启动子之一,可被大肠杆菌 毒素的启动子是最强的启动子之一 可被大肠杆菌 聚合酶所识别,因而 的RNA聚合酶所识别 因而 毒素在自身启动子下 聚合酶所识别 因而α毒素在自身启动子下 不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达,也可在大 不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达 也可在大 肠杆菌中得到高效表达 免疫α毒素的 端功能区,来预防产气荚膜梭菌所 毒素的C端功能区 免疫 毒素的 端功能区 来预防产气荚膜梭菌所 致气性坏疽的发生
（二）毒素
细菌在生长繁殖中产生和释放的毒 性成分，可直接或间接损伤宿主细胞、 性成分，可直接或间接损伤宿主细胞、组 织和器官，干扰其生理功能。 织和器官，干扰其生理功能。
1. 2.
外毒素 内毒素
内毒素毒性作用
(A)热源性 (A)热源性 (B)白细胞数目改变 (B)白细胞数目改变
(C)内毒素血症和休克 (C)内毒素血症和休克
疫苗现状
国内首先出现的是羔羊痢疾，肠毒血症等单价苗， 国内首先出现的是羔羊痢疾，肠毒血症等单价苗， 继之出现了羊猝狙、快疫二联苗，羊黑疫、 继之出现了羊猝狙、快疫二联苗，羊黑疫、快疫 二联苗，快疫、羔羊痢疾、肠毒血症三联苗。文 二联苗，快疫、羔羊痢疾、肠毒血症三联苗。 希喆等(1978)研制成功了快疫、羔羊痢疾、碎 研制成功了快疫、 希喆等 研制成功了快疫 羔羊痢疾、 肠毒血症、黑疫五联苗。纪金春等(1978) 狙、肠毒血症、黑疫五联苗。纪金春等 研制成功了快疫、羔羊痢疾、猝狙、肠毒血症、 研制成功了快疫、羔羊痢疾、猝狙、肠毒血症、 黑疫和肉毒中毒六联苗。 黑疫和肉毒中毒六联苗。
免疫效果与制苗菌液中毒素毒力正相关 抗原含量过大会产生严重局部反应， 抗原含量过大会产生严重局部反应，会导 致安全性检验不合格
主要毒素
α毒素 毒素
各型产气荚膜梭菌均产生α毒素 它是产气荚膜梭 各型产气荚膜梭菌均产生 毒素,它是产气荚膜梭 毒素 菌最重要的毒素之一,同时又是 同时又是A型产气荚膜梭菌 菌最重要的毒素之一 同时又是 型产气荚膜梭菌 的主要毒素 型产气荚膜梭菌的主要毒素。 是A型产气荚膜梭菌的主要毒素。它具有磷脂酶 型产气荚膜梭菌的主要毒素 C(Phospholipase C,PLC)和鞘磷脂酶 和鞘磷脂酶 (Sphin-gomyelinase)两种酶活性 能水解细 两种酶活性,能水解细 两种酶活性 胞膜的主要成分膜磷脂,从而破坏细胞膜结构的完 胞膜的主要成分膜磷脂 从而破坏细胞膜结构的完 整性
β毒素 毒素
产气荚膜梭菌β毒素是由产气荚膜梭菌 型和 产气荚膜梭菌 毒素是由产气荚膜梭菌B型和 型菌株产 毒素是由产气荚膜梭菌 型和C型菌株产 生的坏死、致死性毒素,可引起人和动物的坏死性肠炎 可引起人和动物的坏死性肠炎, 生的坏死、致死性毒素 可引起人和动物的坏死性肠炎 。 β毒素对胰酶敏感，37℃作用 毒素对胰酶敏感， ℃作用30min后即完全失活 毒素对胰酶敏感 后即完全失活 β毒素分为 、β2毒素 其中β2毒素是近年确认的由 型 毒素分为β1、 毒素,其中 毒素是近年确认的由C型 毒素分为 毒素 其中 毒素是近年确认的由 产气荚膜梭菌产生的一种新的毒素。 毒素与 毒素与β1毒素没 产气荚膜梭菌产生的一种新的毒素。β2毒素与 毒素没 有明显的氨基酸序列的同源性,但具有相似的生物学活性 但具有相似的生物学活性。 有明显的氨基酸序列的同源性 但具有相似的生物学活性。 而且,抗 毒素的抗体能识别纯化的 毒素,并能与 毒素的抗体能识别纯化的β2毒素 并能与β1毒 而且 抗β2毒素的抗体能识别纯化的 毒素 并能与 毒 素发生弱反应,然而 然而,抗 毒素的抗体只能与 毒素反应, 毒素的抗体只能与β1毒素反应 素发生弱反应 然而 抗β1毒素的抗体只能与 毒素反应 却不能与β2毒素发生反应 表明二者的免疫学相关性差,但 却不能与 毒素发生反应,表明二者的免疫学相关性差 但 毒素发生反应 表明二者的免疫学相关性差 其机制尚不清楚。 其机制尚不清楚。
、
㈠侵袭力
1、菌体的表面结构 、
黏附素：细菌表面的蛋白质。 黏附素：细菌表面的蛋白质。 菌毛分泌物 细菌的表面组分：如磷壁酸。 细菌的表面组分：如磷壁酸。 荚膜、微荚膜。 荚膜、微荚膜。 2、侵袭性物质：协助病菌抗吞噬或向四周扩散。 侵袭性物质：协助病菌抗吞噬或向四周扩散。 如致病性葡萄球菌凝固酶、 群链球菌透明质酸酶、 如致病性葡萄球菌凝固酶、A群链球菌透明质酸酶、 链激酶等从而有利于细菌在组织中扩散。 链激酶等从而有利于细菌在组织中扩散。
(D)弥漫性血管内凝血（DIC） (D)弥漫性血管内凝血（DIC） 弥漫性血管内凝血
区别要点
外毒素
内毒素 为细菌细胞壁结构成份， 为细菌细胞壁结构成份，菌体 崩解后释出
存在部位
由活的细菌释放至细菌体外
细菌种类
革兰阳性菌多见
革兰阴性菌多见
化学组成 稳定性
蛋白质 60℃～ min破坏 60℃～80℃ 30 min破坏 强，有选择毒害作用，引起特殊临 有选择毒害作用， 床表现 强，可刺激机体产生高效价的抗毒 经甲醛脱毒成为类毒素， 素。经甲醛脱毒成为类毒素，仍有 较强的抗原性， 较强的抗原性，可用于人工自动免 疫
培养特性
本菌虽属厌氧性细菌， 本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要 求并不太严， 条件下， 求并不太严，2%~10%的CO2条件下，生长 的 更好 在普通培养基上能生长，若加葡萄糖， 在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血 液，则生长更好 生长适宜温度为37-47℃，多认为 生长适宜温度为 ℃ 多认为4347℃为最宜温度，在适宜条件下增代时间 ℃为最宜温度， 仅8min
纯化
液体培养基 43°温箱培养 连续传代
65-70°C半小时
3-4小时
镜检
血平板
TSC.石蕊牛奶
菌的 力
侵袭力：病原菌有突破宿主皮肤、 侵袭力：病原菌有突破宿主皮肤、黏膜 免疫防御机制， 生理屏障等 免疫防御机制，进 毒 入体内定居、 入体内定居、繁殖和扩散的能 力 力，包 膜、 膜、 和侵袭
： 有 宿主 生理功能 的
魏氏梭菌及其主要毒素的研究进展
报告内容
综述 分型及其依据 魏氏梭菌概述 纯化及鉴定 细菌毒力
魏氏梭菌产生的毒素
魏氏梭菌毒素研究
四种主要毒素研究进展
综述
革兰氏阳性有荚膜不运动的厌氧大杆菌， 革兰氏阳性有荚膜不运动的厌氧大杆菌，芽孢椭 圆形,位于菌体中央或次极端 位于菌体中央或次极端， 圆形 位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌 体，在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基 在一般培养时不易形成芽胞， 中有利于形成芽胞（菌体形态） 中有利于形成芽胞（菌体形态） 广泛分布于自然界， 广泛分布于自然界，同时也是肠道中的常见菌之 在一定ຫໍສະໝຸດ Baidu件下， 一，在一定条件下，可引起各种严重疾病 发病急、死亡快， 发病急、死亡快，因此对于本病的防制主要用疫 苗进行免疫预防 危害：猝死症，家禽坏死性肠炎， 危害：猝死症，家禽坏死性肠炎，人食物中毒及 家畜肠毒血症、坏死性肠炎， 气性坏疽 ；家畜肠毒血症、坏死性肠炎，痢疾
脂多糖 耐热， 2h～ h破坏 耐热，160℃ 2h～4 h破坏 稍弱， 稍弱，各种细菌内毒素的毒性 作用大致相同。 作用大致相同。
毒性作用
抗原性
刺激机体对多糖成份产生抗体， 刺激机体对多糖成份产生抗体， 不形成抗毒素， 不形成抗毒素，不能经甲醛处 理成为类毒素
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刘家森等克隆了α毒素基因序列中从第 个碱基到中止密码子约900 刘家森等克隆了 毒素基因序列中从第294个碱基到中止密码子约 毒素基因序列中从第 个碱基到中止密码子约 bp的核苷酸序列 并表达出大小约 8 ku的重组蛋白。重组蛋白完全涵盖 的核苷酸序列,并表达出大小约 的重组蛋白。 的核苷酸序列 并表达出大小约3. 的重组蛋白 毒素的羧基末端的蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端内对α毒素起重要作 了α毒素的羧基末端的蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端内对 毒素起重要作 毒素的羧基末端的蛋白序列并缺失掉了位于氨基末端内对 用的Trp1、His11、Asp56、His68等氨基酸残基 表达的重组蛋白含量 等氨基酸残基;表达的重组蛋白含量 用的 、 、 、 等氨基酸残基 占到菌体蛋白总量的30%以上 且表现出良好的反应原性 无毒性现象产生。 以上,且表现出良好的反应原性 无毒性现象产生。 占到菌体蛋白总量的 以上 且表现出良好的反应原性,无毒性现象产生