小鼠卵母细胞的孤雌激活

卵母细胞的孤雌激活

将体外成熟卵母细胞（COCs要提前脱卵丘）分别用M2液及含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液洗3遍，然后将卵母细胞置于含10mM SrCl2的无钙无糖CZB液中培养2.5小时，之后转入不含SrCl2的无糖CZB液中继续培养3.5小时，即在激活处理6小时后观察原核统计激活率。为了维持孤雌激活胚胎的二倍性，激活液和6小时检查原核前短期培养的培养液中均添加5μg/ml的CB。

激活的判定：2原核或2-细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活；卵质膜破裂者判断为死亡；胞质分裂一次或多次但不出现原核者判断为碎裂（fragmentation）。本实验将碎裂卵均归为未激活卵。对照组为未经激活处理，但与激活组培养相同时间的卵母细胞。每次实验，只有当对照组卵母细胞无一激活时，实验组数据才有效。

实验原理：利用氯化锶抑制第二极体的排出

实验用品：培养12小时并老化12小时，即24小时后的卵【要提前脱卵丘】，透明质酸酶，M2操作液，10摩尔每毫升的氯化锶，含钙CZB,

孤雌激活实验步骤

1,，第一天上午杀鼠取卵，培养卵。假设只有一个培养孔的卵，一个孔里最好有20至30个卵，留置第二天孤雌激活。

2,，第二天上午，算好时间，用紫外线照射两个培养孔，15分钟后加液，一个孔里放激活液，【激活液的组成是CB加氯化锶加无钙CZB】，

配置激活液的方法问师兄。另一个孔里放培养液【含钙的CZB】。3，注意激活液不能预热太长时间，CB热时间长会影响效果，【君佐师兄的加法是无钙CZB450微升加上氯化锶50微升平衡20分钟，然后加上氯化锶做滴平衡20分钟就可以放卵了】，在配置激活液时最后应该用枪打一打，好充分混匀。至于放培养液的孔可以以后考虑，激活需要6个小时。把握好时间，脱卵丘后就马上激活。同时预热上需要的药品，包括M2，含钙的CZB，再照上两个中平皿。

4，开始做时先用透明质酸酶处理培养的卵1至3分钟，脱卵丘。再用M2洗3至4遍，再用激活液洗3至4遍，再移入含有激活液的培养孔中。移入培养箱中激活6个小时。

5，假设上午9点做完，下午3点就可以观察。激活的判断方法是2原核或2细胞各具一原核的卵母细胞判断为激活。卵质膜破裂者判断为死亡。胞质分裂一次或多次，但不出现原核者判断为碎裂，本实验将碎裂卵均归为未激活卵。

6，将激活成功的卵母细胞用含钙的CZB培养液洗5至6遍，再转移如含钙CZB的培养孔中培养，理论上48小时后就可以看到4细胞期，此时再转入含糖含钙CZB胚胎培养液中培养，即可以到达囊胚期。