B族链球菌检测的标准操作程序

B族链球菌检测的标准操作程序

【目的】

保证检测结果准确可靠。

【适用范围】

适用于本实验室的检验人员。

【该SOP 变动程序】

本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP 的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【试剂】

1.试剂名称：B族链球菌（GBS）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

2.生产厂家：北京现代高达生物技术有限责任公司

3.包装规格：20人份/盒

贮藏条件及有效期：试剂盒应置2－8℃存放12个月。

【仪器设备】

1.仪器名称：

2.仪器厂家：

3.仪器型号：

4.仪器校准：本仪器由仪器厂家工程师负责校准。

【检验原理】

本试剂盒利用Taqman探针实时PCR技术，针对B族链球菌基因组特异且无高频SNP位点的序列区域cAMP因子，设计出特异性引物和探针，配以全封闭PCR体系，检测标本中的B族链球菌DNA。体系中通过加入内参照系统排除PCR反应过程中可能的假阴性结果，并通过加入UNG避免可能的扩增污染物造成的假阳性结果。

【标本要求】

1. 样本采集：采用藻酸钙、普通棉拭子或涤纶拭子采集生殖道或直肠等部位带上皮细胞的分泌物标本。（1）妊娠34-37周孕妇生殖道分泌物：先拭去阴道过多的分泌物，采用无菌拭子插入阴道至内1/3处，沿阴

道壁轻轻旋转取得分泌物，将采集的拭子置于无菌管中，密闭送检；

（2）妊娠34-37周孕妇直肠分泌物：将拭子插入肛门，在肛门括约肌以上约2.5cm处，沿肠壁轻轻旋转取得标本，将采集的拭子置于无菌管中，密闭送检；

（3）样本一经送检，则应尽快送至检测实验室，运输应符合当地法规。

2. 标本存放：待测样本在2-8℃保存不应超过24小时；-18℃以下保存不超过4天。

样本的冻融次数：实验数据证明，样本冻融6次以内无影响，但应尽量避免冻融。

3. 样本的运输条件：冷冻（干冰运输）4天内无影响，冷藏（冰袋运输）2天内无影响。

4. 含血样本无法正常检测应避免。

5. 研究显示，常用栓剂药物“保妇康栓”会对试剂盒检测造成较大影响，因此取样前应避免该药品的使用。【检验方法】

1. DNA提取（在样品处理区操作）（1）妊娠34-37周孕妇生殖道或直肠分泌物：取含有分泌物的生理盐水1ml13000rpm离心10 min，弃上清液，沉淀（如不明显可再重复一遍离心）加无菌生理盐水1ml混匀，13000rpm离心5 min，弃上清。沉淀加入50μl DNA提取液充分混匀，99℃~100℃加热处理10min，13000rpm 离心10min，吸取上清至1.5ml离心管中保存，DNA提取完毕。

（2）GBS阳性对照品提取：取50μlGBS阳性对照品加入1.5ml离心管中（用灭菌生理盐水补齐至1ml），13000rpm离心10min，弃上清。沉淀加入50μl DNA提取液充分混匀，99-100℃加热处理10min，13000rpm离心10min，吸取上清至1.5ml离心管中保存，DNA提取完毕。

（3）空白对照品提取：同GBS阳性对照品提取。

建议：DNA提取完毕后应尽快进行PCR检测，以保证检测效果；

2. GBS PCR反应液配制（在试剂准备区进行）

解冻试剂，在打开盖子之前震荡并短暂离心各试剂管。按标本数量（需包含阴性对照品及GBS阳性对照品）分装GBS PCR反应液。按每管35μl分装至0.2ml PCR反应管/板中，转入样品处理区。

3. 加样（在样品处理区进行）

分装好的各反应管/板分别加入处理好的DNA样品5μl、阴性对照品5μl及阳性对照品各5μl。短暂离心使所有试剂集中到反应管底部（不能有气泡），确定盖好管盖或封膜后，立即进行PCR 扩增反应。

注意：阳性定量参考品含有高浓度的目标DNA，请务必小心操作，避免污染

4. PCR 扩增（在PCR 检测区进行）

按以下方案运行仪器程序：

（1）UNG 反应：50℃2 min；

（2）预变性：95℃5min；

（3）PCR：(95℃15sec→60℃35sec) 45 个循环；60℃时分别检测FAM 和HEX 通道荧光信号，选择反应体系40 μl。

5. 阈值设定

阈值设定在空白对照正常扩增曲线的上方，基线设定可选择3-5 个循环，一般情况选择为5.00，若是最高浓度样本的Ct 值小于5.00，则在3~5 之间按照低于最高浓度样本Ct 值设定；这类高浓度样本应稀释后再进行检测。具体仪器设定如下：

ABI 7500 基线、阈值设定：调整Baseline 的Start 值可在3~5 之间，End 值≤5.00，阈值线设定以刚好超过正常空白对照扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，即空白对照Ct 值或者“Undet”为准；

6. 质量控制

（1）FAM 通道检测结果：

a) 空白对照品：Ct 值不显示；

b) CT 阳性对照品：Ct<30.00；

（2）HEX 通道检测结果：内参照：Ct≤35.00；

注：以上要求需在同一次实验中同时满足。

7. 检测结果分析和判定

（1）阴性结果判定：如果FAM 通道无Ct 值显示, 而HEX 通道信号正常（Ct≤35.00），则该样品为阴性; （2）阳性结果判定：

a) 若样品的FAM 通道Ct≤38.00，则判定样品为阳性；

b) 若样品的38.00

通道信号正常（Ct≤35.00），则判定为阴性。

注：HEX 通道是内参照的信号通道，通过HEX 信号检测可排除由于PCR 体系的干扰因素或性能下降造成的假阴性反应。

8. 扩增曲线形态：正常扩增为标准S 形扩增曲线

【结果解释】

实验室存在试剂污染，样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输；保存不当或试剂配置不准确引起的试剂性能下降，出现假阴性或试剂定量不准确的结果。内参照HEX 通道无Ct 值显示表明PCR 反应受到抑制，扩增失败。本试剂盒检测结果不能直接作为临床确诊或排除病例的依据，仅供临床医生参考。

【检验方法的局限性】

当待检测样本中被检测核酸浓度低于1×103 基因拷贝/ml 时可能会发生假阴性结果。

【注意事项】

1. 实验前请仔细阅读本说明书；

2. 每次实验应设置阴性对照品；试剂使用前应充分融化并混匀；自备灭菌生理盐水；

3. 反应管中应尽量避免气泡的产生，管盖需盖紧；

4. 实验室必须严格遵循PCR 基因扩增实验室的管理规范，操作人员必须经过培训，合格后方能上岗；

5. 实验过程严格分区进行，即试剂准备区、样本处理区和PCR 检测区，各区的白大衣、手套和帽子等不能带入其它区域，各区仪器设备不能带入其它区域；

6. 请使用无菌带滤芯吸头，实验中废弃的吸头应弃于含10%次氯酸钠的废液缸中；实验全过程必须带一次性手套；

7. 扩增结束后不要打开管子，应密封丢弃于指定容器中；

8. 实验完毕用10%次氯酸钠或75%酒精清理实验工作台及移液器等相关物品，并用紫外灯照射；

9. 不同批号的试剂不得混用，请勿使用过期产品；

10.请根据所使用荧光PCR 仪选择相配套的PCR 管/板。

11.仅用于体外诊断。

操作人员部门主管质量负责人姓名**** **** ****

日期年月日