长期施肥对土壤微生物量的影响.pdf

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长期施肥对土壤微生物量的影响
试剂购买
序号 试剂名称
规格
1
牛肉膏
500g/瓶
2
蛋白胨
500g/瓶
3
琼脂
500g/瓶
4 可溶性淀粉 500g/瓶
5
葡萄糖
500g/瓶
6
氯化钠
500g/瓶
7
硝酸钾
100g
8 磷酸氢二钾
500g
9 7 水硫酸镁 500g/瓶
10 硫酸亚铁
500g/瓶
11 孟加拉红
数量 15 3 2 70 200 8 1 1 若干 1 1 1 1 1 1
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培养基及配置方法
牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）
牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl
5g，琼脂 15～20g，水
1000ml，pH7.0～7.2，121℃灭菌 20min。
高氏（Gause）1 号培养基（培养放线菌用）
2
备注
未特别注 明，所用 化学试剂 均为分析
纯
数量 1
3
3 3 1 2 1 1 若干 3 若干 若干 1 1
仪器名称 移液枪（枪头）
烧杯
试管 培养皿 玻璃珠三角瓶 牛角匙 乳胶管 称量纸 酒精灯 记号笔 高压蒸汽锅 铁架台（环） 震荡机 培养箱
规格 1ml 1000ml 500ml 10ml
100ml
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度 3 次重复的平均菌落数×稀释倍数。
源自文库
基中含链霉素 30µg。
配制步骤 1、称量
按培养基配方比例依次准确地称取所需药品放入搪瓷杯中。牛肉膏常用玻 棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，其他的放在称 量纸上称量。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。 2、溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，在电炉或搅拌器 上加热使其溶解。待药品完全溶解后，加入琼脂，直至琼脂完全溶化，补充水 分到所需的总体积。 3、调 pH
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度 3 次重复的平均菌落数×稀释倍数。
3、土壤中真菌的检测 1、在超净工作台中，无菌称取所取土样 10g，分别溶于装 90ml 无菌水及
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玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡 30 分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液 1ml 移入装 9ml 无菌水试管中，此即为 10-2 稀释的土壤悬液。如此操作，一直 到 10-10 。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量) 2、分别无菌吸取各样品 10-2、10-3、10-4、10-5 稀释液，加入灭菌平皿中(每 稀释度 3 皿，每皿 lml)，倒人 45℃恒温水浴的灭菌马丁氏（Martin）琼脂培养 基，混匀。（稀释倍数是情况而定） 3、待培养基凝固后，将平皿倒置于 28℃恒温培养箱中培养。 4、培养 48h 后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀 释度 3 个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在 30-300 之间的），并按下列 公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用）
葡萄糖 10g，蛋白胨 5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，1/3000 孟加拉红
（rosebengal，玫瑰红水溶液）100ml，琼脂 15～20g，pH 自然，蒸馏水
800ml，121 度灭菌 30min。临用前加入 0.03%链霉稀释液 10ml，使每毫升培养
在未调 pH 前，先用精密 pH 试纸测量培养基的原始 pH 值，在用滴管向培 养基中逐滴加入 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl，边加边搅拌，使其 pH 值达到要求。
4、分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。 分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 (1)液体分装分装高度以试管高度的 1/4 左右为宜。 (2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的 1/5，灭菌后制成斜面。 (3)半固体分装试管一般以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。 5、加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，（试管 7 个一组加牛 皮纸，棉线包扎；三角烧瓶牛皮纸以活结包扎；摇瓶培养用八层纱布）用记号 笔注明培养基名称、组别、日期。 6、灭菌 将上述培养基以 0.103MPa，121.3℃， 20 分钟高压蒸汽灭菌。 7、搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至 50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长 度以不超过试管总长的一半为宜。
12
链霉素
25g/瓶
13
NaOH
14
HCl
注：链霉 硫酸链霉素 素替代品 庆大霉素 25g/瓶
仪器
仪器名称
规格
搪瓷杯
玻棒
量筒
玻璃滴管 漏斗(过滤、培养基)
天平 弹簧夹 精密 PH 试纸 接种环 棉花（橡皮塞） 牛皮纸/棉纱线/纱布 电磁炉（搅拌器） 放大镜
100ml 10ml
需要数量 （单位：瓶）
1 2 4 2 2 1 1 1 1 1 最小包装 1-2 1 1
可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 .7H2O
0.5g，FeSO4 0.01g，琼脂 20g，水 1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用少量冷
水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，
溶化后，补足水分至 1000ml。121℃灭菌 20min。
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8、无菌检查 将灭菌的培养基放入 37℃的温室中培养 24—48 小时，以检查灭菌是否彻底。 简要步骤 在烧杯内加水 100 毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上 记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘 底。等琼脂完全溶解后补足失水，用 10%盐酸或 10%的氢氧化钠调整 pH 值到 7.2～7.6,分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌：1.05 千克每平方厘 米、121 摄氏度维持 15~30 分钟。
检测方法
1、土壤中放线菌的检测 1、 在超净工作台中，无菌称取所取土样 10g，分别溶于装 90ml 无菌水及玻璃 珠三角瓶中，于摇床震荡 30 分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液 1ml 移入装 9ml 无菌水试管中，此即为 10-2 稀释的土壤悬液。如此操作，一直到 10-10 。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量) 2、 倒人 45℃恒温水浴的灭菌高氏 l 号培养基，水平放置，凝固待用；分别无 菌吸取各样品 10-4、10-5、10-6、10-7 稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度 3 皿， 每皿 lml)，用玻璃涂布棒涂抹均匀，将平皿倒置于 28℃恒温培养箱中培养。放 线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多 3、 培养 48h 后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一 稀释度 3 个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在 30-300 之间的），并按下 列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度 3 次重复的平均菌落数×稀释倍数。
2、土壤中细菌的检测 1、 在超净工作台中，无菌称取所取土样 10 g，分别溶于装 90ml 无菌水及玻璃 珠三角瓶中，于摇床震荡 30 分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液 1ml 移入装 9ml 无菌水试管中，此即为 10-2 稀释的土壤悬液。如此操作，一直到 10-10 。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量) 2、分别无菌吸取各样品 10-5、10-6、10-7、10-8 稀释液，加入灭菌平皿中(每 稀释度 3 皿，每皿 lml)，倒人 45℃恒温水浴的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基，混匀。 （稀释倍数是情况而定） 3、待培养基凝固后，将平皿倒置于 37℃恒温培养箱中培养。 4、培养 24h 后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀 释度 3 个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在 30-300 之间的），并按下列 公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。