开题报告
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[2]Mead DG,Ramberg FB,Besselsen DG,etal.Transmission of vesicular stomatitis virus from infected to noninfected black flies co-feeding on nonviremic deer mice [J]. Science,2000,287: 485-487
存在问题：
病毒对细胞又何影响
病毒能否在CIK细胞中复制
能否引起CIK细胞单层产生空斑
研究目标和内容
目标：
本实验用VSV病毒感染草鱼肾细胞（CIK细胞），分别于攻毒后12h、24h、36h后观察其细胞病变效应，同时利用RT-PCR方法检测其在CIK细胞中的复制。观察细胞病变效应发现，病毒感染后的细胞圆缩、聚集、脱落、并有空泡形成。随着时间的延长，病变效应加剧，并逐渐凋亡。RT-PCR结果证实了VSV病毒可在CIK 细胞中复制。在空斑实验中，证实了VSV病毒不能使CIK细胞单层产生蚀斑。
(1)病毒RNA的提取(2)cDNA合成 (3)PCR扩增(4)电泳鉴定
4.VSV病毒对CIK细胞单层的空斑实验
在24孔板中进行细胞铺板，当细胞生长至70%~80%时，弃去原培养液，加入梯度稀释后的病毒液，孵育 h后弃去病毒液，加入含%小牛血清的甲基纤维素覆盖，置于27℃恒温箱中培养，3 d后弃去甲基纤维素，用%的结晶紫染色1min，漂洗，风干，观察空斑和计数。
湖州师范学院毕业设计（论文）开题报告
学生姓名
高霞婷
班级
060922
学号
06092204
专 业
生物技术
指导教师
采克俊
刘 莉
开题时间
设计（论文）题目
水泡性口炎病毒在草鱼肾细胞中的复制和病变效应
选题意义研究现状及存在问题
选题意义：
水泡性口炎病毒（VSV病毒）为弹状病毒科（Rhabdoviridae）,水泡病毒属（vesiculovirus）,其代表种是水泡性口炎病毒印第安纳（VSV Indiana）株和新泽西（VSV-New Jersey）株。VSV病毒引起的水泡性口炎（Vesicular stomatitis, VS）是一种急性高度接触性传染疾病，以马、牛、猪等动物较易感染，绵羊和山羊也可感染。临床上以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水疱为主要特征，还有糜烂及溃疡，其症状与口蹄疫(FMD)、猪水疱病(SVD)相似。人也有感染VS，引起流感样症状。本病被国际兽疫局(OIE)列为A类疾病。在我国VS为外来动物病，国家进出境动物检疫对象中将VS列为二类疫病。随着经济发展的国际化，动物及动物产品的国际贸易量逐渐增加，外来动物病传入我国的风险日益加大。为防止国外动物疫病入境，保护我国畜牧业及水产业的健康发展，对该病进行充分的了解和研究具有特别重要的意义，尤其是对病原——VSV病毒的研究。
[3]杨桂梅,徐自忠,高洪.水泡性口炎研究进展[J].云南畜牧兽医,2004(2):7-9
[4]殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科技出版社,1997,799-804
[5]Nunez J I, Blanco E, Hernandez T. A RT-PCR assay for the differential diagnosis ofvesicular viral disease of swine [J ].Journal ofVirological Methods,1998,72 :227-235
第六阶段 论文修改2009年12月1日-2009年12月14日
第七阶段 论文审核2009年12月15日-2009年12月26日
第八阶段 准备论文答辩2009年12月27日-2010年1月3日
主要参考文 献系统的建立及重组病毒的构建[D].内蒙古:内蒙古农业大学,2006
指导教师审核意 见
VSV病毒引起的水疱性口炎是一种急性接触感染疾病，对VSV病毒的研究可为该疾病的诊断奠定基础。且该同学已经通过阅读大量中英文文献，对选题的背景、内容、意义已经有了较全面的了解；熟悉基因工程流程，掌握该实验相关操作。实验方案已经确定，可以进行论文的实验研究工作。
指导教师（签名）
2009年6月29日
内容：
1.翻译一篇与实验研究相关的英文文献；
2.综述VSV病毒的研究概况；
细胞培养；
4.用VSV病毒感染CIK细胞；
5.病毒RNA制备及RT-PCR测定CIK细胞中VSV病毒的复制；
6.实验数据整理及结果分析。
研究方法步骤和措施
1.CIK细胞培养
用高糖DMEM培养基培养CIK细胞，置27℃恒温箱中培养。每天观察，及时更换培养液。
研究现状：
VSV病毒的诊断方法较多，包括病毒的分离培养、电镜观察、琼脂免疫扩散、免疫电泳、酶联免疫吸附试验（ELISA）、补体结合(CF)试验、中和试验（VN）、聚合酶链式反应（PCR）等。OIE推荐夹心ELISA(IS-ELISA)、CF用于鉴定病毒抗原，液相阻断ELISA(LP-ELISA)、VN、CF则用于血清学试验。而PCR法则是近年来发展起来是一种快速、高敏感、准确的诊断技术。该法全部试验可在1d内完成，能够达到快速诊断的目的，并且具有很好的特异性与重复性，国内外都有相关的研究报道。目前，国内外有关关鱼类病毒的研究包括鲑草梅病毒(TSD)、淋巴囊肿病毒(LCDV)、系统性虹彩病毒(SU)、斑点叉匙回病毒病(CCDV)、银大麻哈鱼疙疹病毒(SaHV-2)、传染性胰坏死病毒病(IPNV)、鰤鱼腹水病(YAV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、春季鲤病毒(SVCV)、白斑狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)、草鱼出血病病毒(GCHV)等。但是关于VSV病毒对鱼类影响方面的报道并不多，因此研究该病毒对鱼类的影响成为了一个迫不及待的课题。
[17]黄运生.间接ELISA诊断水泡性口炎[J].中国兽医杂志,1989,15 (4):47-49
[18]陈茹,刘中勇,曾碧健,等.水泡性口炎病毒血清型特异LUX实时荧光RT-PCR检测方法的建立[J],畜牧兽医学报,2008,39(4) :522-528
[19]杨桂梅,徐自忠.VSV的RT-PCR快速检侧方法的建立[J].动物科学与动物医学,2003,20(2):23-25
[14]孟继鸿,张建峰.一种新的病毒空斑技术[J].东南大学学报,1985,1:36-40
[15]于大海,崔砚林.中国进出境动物检疫规范[M].北京:中国农业出版社,1997 :485
[16]王海霞,郑增忍,龚振华,等.水泡性口炎病毒N基因的克隆及其PCR检测方法的建[J],中国兽医科技,2003,12(33):11-14
[11]周珍辉,李玉冰,王晓梅.动物细胞培养技术[M].北京:中国环境科学出版社,2006:148-149
[12]顺方舟.脊硅灰质炎[M].上海:上海科学技术出版社,1984,509
[13]李明才,马春桃,刘连成,等.武汉1997-1999年口服脊髓灰质炎三价疫苗效价监测.湖北预防医学杂志,2000,11(1):38
[9]褚秀玲,苏建青,高丰.水泡性口炎病毒诱导BHK-21细胞凋亡的初步研究[J].河北北方学院学报(自然科学版),2005,21(1):68-71
[10]Éva G,György S,Eniko S,et al.Vesicular stomatitis virus induces apoptosis in the Wong–Kilbourne derivative of the Chang conjunctival cell line[J].Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology,2006,244:717-724
[6]王春艳.病毒感染与细胞凋亡[J].细胞与分子免疫学杂志,2007,23(4):387-389
[7]刘翠燕,兽医中药免疫增强及的筛选及其药理学研究[D].山东:山东农业大学,2007
[8]褚秀玲,苏建青,韦旭斌.水泡性口炎病毒人工感染小白鼠的免疫病理学研究[J].安徽农业科学,2008,36(30):
研究的总体安排与进 度
第一阶段 确定研究课题并制定研究计划2009年6月8日-2009年6月30日
第二阶段 收集资料和研究参考文献2009年7月1日-2009年7月15日
第三阶段 进行预试验2009年7月16日-2009年8月1日
第四阶段 进行整体试验2009年8月2日-2009年10月31日
第五阶段 撰写论文2009年11月1日-2009年11月30日
2.用VSV病毒感染CIK细胞
在培养瓶中进行细胞铺板，当细胞生长至70%~80%时，弃去原培养液，加入980µl高糖DMEM培养液（不含双抗、不含胎牛血清）及20µl1000µg/mL的VSV病毒，体积比为1/50，置27℃恒温箱中培养。分别在12h、24h、36h后，显微镜拍照记录细胞病变。
3.总RNA制备及RT-PCR测定CIK细胞中VSV病毒的复制
存在问题：
病毒对细胞又何影响
病毒能否在CIK细胞中复制
能否引起CIK细胞单层产生空斑
研究目标和内容
目标：
本实验用VSV病毒感染草鱼肾细胞（CIK细胞），分别于攻毒后12h、24h、36h后观察其细胞病变效应，同时利用RT-PCR方法检测其在CIK细胞中的复制。观察细胞病变效应发现，病毒感染后的细胞圆缩、聚集、脱落、并有空泡形成。随着时间的延长，病变效应加剧，并逐渐凋亡。RT-PCR结果证实了VSV病毒可在CIK 细胞中复制。在空斑实验中，证实了VSV病毒不能使CIK细胞单层产生蚀斑。
(1)病毒RNA的提取(2)cDNA合成 (3)PCR扩增(4)电泳鉴定
4.VSV病毒对CIK细胞单层的空斑实验
在24孔板中进行细胞铺板，当细胞生长至70%~80%时，弃去原培养液，加入梯度稀释后的病毒液，孵育 h后弃去病毒液，加入含%小牛血清的甲基纤维素覆盖，置于27℃恒温箱中培养，3 d后弃去甲基纤维素，用%的结晶紫染色1min，漂洗，风干，观察空斑和计数。
湖州师范学院毕业设计（论文）开题报告
学生姓名
高霞婷
班级
060922
学号
06092204
专 业
生物技术
指导教师
采克俊
刘 莉
开题时间
设计（论文）题目
水泡性口炎病毒在草鱼肾细胞中的复制和病变效应
选题意义研究现状及存在问题
选题意义：
水泡性口炎病毒（VSV病毒）为弹状病毒科（Rhabdoviridae）,水泡病毒属（vesiculovirus）,其代表种是水泡性口炎病毒印第安纳（VSV Indiana）株和新泽西（VSV-New Jersey）株。VSV病毒引起的水泡性口炎（Vesicular stomatitis, VS）是一种急性高度接触性传染疾病，以马、牛、猪等动物较易感染，绵羊和山羊也可感染。临床上以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水疱为主要特征，还有糜烂及溃疡，其症状与口蹄疫(FMD)、猪水疱病(SVD)相似。人也有感染VS，引起流感样症状。本病被国际兽疫局(OIE)列为A类疾病。在我国VS为外来动物病，国家进出境动物检疫对象中将VS列为二类疫病。随着经济发展的国际化，动物及动物产品的国际贸易量逐渐增加，外来动物病传入我国的风险日益加大。为防止国外动物疫病入境，保护我国畜牧业及水产业的健康发展，对该病进行充分的了解和研究具有特别重要的意义，尤其是对病原——VSV病毒的研究。
[3]杨桂梅,徐自忠,高洪.水泡性口炎研究进展[J].云南畜牧兽医,2004(2):7-9
[4]殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科技出版社,1997,799-804
[5]Nunez J I, Blanco E, Hernandez T. A RT-PCR assay for the differential diagnosis ofvesicular viral disease of swine [J ].Journal ofVirological Methods,1998,72 :227-235
第六阶段 论文修改2009年12月1日-2009年12月14日
第七阶段 论文审核2009年12月15日-2009年12月26日
第八阶段 准备论文答辩2009年12月27日-2010年1月3日
主要参考文 献系统的建立及重组病毒的构建[D].内蒙古:内蒙古农业大学,2006
指导教师审核意 见
VSV病毒引起的水疱性口炎是一种急性接触感染疾病，对VSV病毒的研究可为该疾病的诊断奠定基础。且该同学已经通过阅读大量中英文文献，对选题的背景、内容、意义已经有了较全面的了解；熟悉基因工程流程，掌握该实验相关操作。实验方案已经确定，可以进行论文的实验研究工作。
指导教师（签名）
2009年6月29日
内容：
1.翻译一篇与实验研究相关的英文文献；
2.综述VSV病毒的研究概况；
细胞培养；
4.用VSV病毒感染CIK细胞；
5.病毒RNA制备及RT-PCR测定CIK细胞中VSV病毒的复制；
6.实验数据整理及结果分析。
研究方法步骤和措施
1.CIK细胞培养
用高糖DMEM培养基培养CIK细胞，置27℃恒温箱中培养。每天观察，及时更换培养液。
研究现状：
VSV病毒的诊断方法较多，包括病毒的分离培养、电镜观察、琼脂免疫扩散、免疫电泳、酶联免疫吸附试验（ELISA）、补体结合(CF)试验、中和试验（VN）、聚合酶链式反应（PCR）等。OIE推荐夹心ELISA(IS-ELISA)、CF用于鉴定病毒抗原，液相阻断ELISA(LP-ELISA)、VN、CF则用于血清学试验。而PCR法则是近年来发展起来是一种快速、高敏感、准确的诊断技术。该法全部试验可在1d内完成，能够达到快速诊断的目的，并且具有很好的特异性与重复性，国内外都有相关的研究报道。目前，国内外有关关鱼类病毒的研究包括鲑草梅病毒(TSD)、淋巴囊肿病毒(LCDV)、系统性虹彩病毒(SU)、斑点叉匙回病毒病(CCDV)、银大麻哈鱼疙疹病毒(SaHV-2)、传染性胰坏死病毒病(IPNV)、鰤鱼腹水病(YAV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、春季鲤病毒(SVCV)、白斑狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)、草鱼出血病病毒(GCHV)等。但是关于VSV病毒对鱼类影响方面的报道并不多，因此研究该病毒对鱼类的影响成为了一个迫不及待的课题。
[17]黄运生.间接ELISA诊断水泡性口炎[J].中国兽医杂志,1989,15 (4):47-49
[18]陈茹,刘中勇,曾碧健,等.水泡性口炎病毒血清型特异LUX实时荧光RT-PCR检测方法的建立[J],畜牧兽医学报,2008,39(4) :522-528
[19]杨桂梅,徐自忠.VSV的RT-PCR快速检侧方法的建立[J].动物科学与动物医学,2003,20(2):23-25
[14]孟继鸿,张建峰.一种新的病毒空斑技术[J].东南大学学报,1985,1:36-40
[15]于大海,崔砚林.中国进出境动物检疫规范[M].北京:中国农业出版社,1997 :485
[16]王海霞,郑增忍,龚振华,等.水泡性口炎病毒N基因的克隆及其PCR检测方法的建[J],中国兽医科技,2003,12(33):11-14
[11]周珍辉,李玉冰,王晓梅.动物细胞培养技术[M].北京:中国环境科学出版社,2006:148-149
[12]顺方舟.脊硅灰质炎[M].上海:上海科学技术出版社,1984,509
[13]李明才,马春桃,刘连成,等.武汉1997-1999年口服脊髓灰质炎三价疫苗效价监测.湖北预防医学杂志,2000,11(1):38
[9]褚秀玲,苏建青,高丰.水泡性口炎病毒诱导BHK-21细胞凋亡的初步研究[J].河北北方学院学报(自然科学版),2005,21(1):68-71
[10]Éva G,György S,Eniko S,et al.Vesicular stomatitis virus induces apoptosis in the Wong–Kilbourne derivative of the Chang conjunctival cell line[J].Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology,2006,244:717-724
[6]王春艳.病毒感染与细胞凋亡[J].细胞与分子免疫学杂志,2007,23(4):387-389
[7]刘翠燕,兽医中药免疫增强及的筛选及其药理学研究[D].山东:山东农业大学,2007
[8]褚秀玲,苏建青,韦旭斌.水泡性口炎病毒人工感染小白鼠的免疫病理学研究[J].安徽农业科学,2008,36(30):
研究的总体安排与进 度
第一阶段 确定研究课题并制定研究计划2009年6月8日-2009年6月30日
第二阶段 收集资料和研究参考文献2009年7月1日-2009年7月15日
第三阶段 进行预试验2009年7月16日-2009年8月1日
第四阶段 进行整体试验2009年8月2日-2009年10月31日
第五阶段 撰写论文2009年11月1日-2009年11月30日
2.用VSV病毒感染CIK细胞
在培养瓶中进行细胞铺板，当细胞生长至70%~80%时，弃去原培养液，加入980µl高糖DMEM培养液（不含双抗、不含胎牛血清）及20µl1000µg/mL的VSV病毒，体积比为1/50，置27℃恒温箱中培养。分别在12h、24h、36h后，显微镜拍照记录细胞病变。
3.总RNA制备及RT-PCR测定CIK细胞中VSV病毒的复制