脓毒血症大鼠模型建立

CLP致脓毒血症大鼠模型建立

一、实验目的

利用CLP技术建立脓毒血症大鼠模型

二、实验原理

脓毒血症患者最常见的感染源来自腹腔且易造成腹腔感染，所以腹腔感染模型是目前最常见的动物模型。鼠类盲肠结扎穿刺（CLP）是临床研究脓毒血症常见模型，是模仿腹腔脓毒血症感染的临床过程，引起多菌群感染，最终导致脓毒血症。

三、实验材料和设备

成熟期雄性Sprague-Dawley大鼠，体重400-500g。

外科手术器械：手术台，手术刀，刀片，剪刀，刮毛器，镊子，止血钳，持针器，缝皮针，1号线，4号肠线，18g针头，血管夹，医用胶布，PE50导管（厂家），探针，硬膜外穿刺针，肝素帽，留置针，注射器（规格）。

实验药品：1.5%戊巴比妥钠，2%利多卡因，丁苯诺啡，75%酒精，碘伏，肝素钠（10000U），蒸馏水，生理盐水。

四、实验方法和步骤

1.购买SD大鼠，适应性饲养1周，自由饮水，饮食；

2.术前禁食12小时；

3.称重以1.5%戊巴比妥钠40mg/kg（4%水合氯醛 0.1ml/10g抽取麻药，一般3-5分钟起效，可以维持1小时左右。），腹腔注射（先将动物固定,腹部用酒精棉球擦试消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约0.5厘米，再使针头与皮肤呈45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。），麻醉大鼠，止血钳夹小鼠脚趾确定麻醉深度；

4.将大鼠背位固定于手术台上，剪去颈部和腹部被毛；

5.取血导管的制备：取PE50导管约15cm，一侧剪契口，另一端平口，对楔面要进行简单打磨处理,以防表面粗糙划破血管外壁。抗凝处理是将导管用装满肝素钠的注射器灌流、冲洗,保证导管每个部位都充分接触肝素钠。

6.颈静脉置管术：

a.用碘伏常规消毒颈部，铺无菌手术单。

b.于胸锁乳突肌连线中点起向颈部垂直延伸15mm,做皮肤切口约1.5cm，暴露皮下结缔组织，用血管钳逐层钝性分离至显露颈静脉(特征是在胸廓入口处，有轻微搏动，直径2～4 mm)，2%利多卡因3-5滴局部浸润1min，完全游离一段长1-1.5cm血管，血管夹分别夹闭远心端和近心端，血管下穿过两根1号线。

c.在游离颈静脉中间部位，用镊子提起血管壁，全层剪一“V”形小口，约占静脉的1/3。预先植入探针，再将导管沿切口缓慢送入静脉切口，轻轻开放近心端的血管夹，将导管植入2.5-3cm，可见有血回流或回抽有血。1号线结扎固定导管，松紧适宜，再次回抽，确定导管在血管内，结扎远心端，开放远心端血

管夹。

d.将导管连同附近少许肌肉缝合固定2-3针，连续缝合切口，留0.5cm切口，以便导管穿过颈部，固定在颈部背侧。

e.导管固定：将大鼠将大鼠翻身置于实验台上，颈后部备皮、消毒，剪一小口，用硬膜外穿刺针沿皮下穿至颈部切口处，拔出针芯，将导管置入穿刺针中，在其引导下，从颈背部穿出，皮肤外留约2cm，连接接头，回抽，确定无误后，将充满肝素盐水的导管接头和肝素帽接好，在颈背部用4号线缝合3～4针固定。缝合剩余切口，并用75%酒精消毒。

7.将大鼠仰卧位固定在手术台上，腹部备皮，碘伏常规消毒，铺无菌手术单。

8.用手术刀于下腹部正中央，做一1-1.5cm纵行切口。

9.逐层打开肌层、筋膜、腹膜层。

10.找到盲肠一般位于腹部左侧，小心分离其远端及大肠系膜，用钝镊小心取出。

11.于盲肠末端1/4处，用4号肠线行结扎术，用18-gauge needle穿孔2个，需避开回盲部，将内容物挤出少部分，保证孔的通畅性，将肠内容物推至盲肠末端。

12.回纳盲肠至腹腔，关腹。单纯连续缝合腹膜筋膜肌肉，间断缝合皮肤。

13.用预热的生理盐水（37℃，5ml/100g）皮下注射

14.注射丁苯诺啡（0.05mg）皮下，止痛，可每6h一次。

15.用注射针头接1ml注射器于下腹部耻骨联合之上，腹正中线穿刺。取钝角进针，针头穿过皮肤后稍微改变角度，以避免穿刺后漏尿，然后刺向膀胱方向，边缓慢进针边回抽，直到抽到尿液为止。

16.大鼠复苏后将大鼠分成二个亚组颈静脉取血（A 亚组：CLP 0、 12、24、48 小时后取血；B 亚组：CLP 3、6、18 及72 小时后取血），同时所有大鼠通过膀胱穿刺取尿回笼子，活动在22-25℃环境下，食物和水不受限制。刺法留取尿液标本。

四、注意事项

1.AB分组并非对照实验组，而是为了避免大鼠失血少于20%，引发休克，采取的分组取血，每次取血留样为0.8ml，保存温度为：-80℃。

2.该实验确定AKI程度为RIFLE标准，在同等时间点时，取血测定肌酐值，需要多少的血液标本才能测定，RIFLE标准：轻度: RIFLE-R，肌酐为基础值的150%；中度：RIFLE-I，肌酐为基础值的200%；重度：RIFLE-F，肌酐为基础值的300%。

3.血液标本是用血清测量？：取静脉血5ml，室温静置30min,4℃离心机3000R离心15min，取上层血清，-80℃保存。用什么管子保存标本。

4.血清保存管是否需要抗凝，抗凝剂用什么。血清肌酐，目前拟定不需要抗凝，取血清样本测肌酐。

5.种鼠对实验是否有影响，实验室只有5-6周龄大鼠，100-150g左右，种鼠有老年期大鼠，400-500g。