羊水细胞培养染色体制备常规

羊水细胞培养染色体制备常规

一、羊膜腔穿刺的时间及方法：

1、羊膜腔穿刺的时间：最理想是在妊娠16~20周进行羊膜腔穿刺。

2、羊膜腔的穿刺方法：

1）B型起声定位穿刺点，预先确定胎盘和胎头部位，尽量避开胎盘附着处进针。

2）、嘱孕妇排尽尿，以使膀胱空虚。

3）、检查穿刺部位的皮肤有无疖肿、皮炎，感染等不适合穿刺的情况。

4）、仰卧手术台上，然后嘱病人翻身数次，以使羊膜腔内脱落的细胞悬浮。

5）、恢复仰卧位后，按常规消毒腹部皮肤，铺上消毒孔巾。

6）、穿刺针通过腹壁、子宫，进入羊膜腔的过程中，术者会体会到三种不同的弹性阻抗性。当估计穿刺针已进入羊膜腔后，轻轻抽出穿刺针针芯，接上无菌注射器。

7）、为了防止穿刺时注射器针头内混有母体细胞，可将先抽出的1~2ml羊水弃去，然后更换注射器再抽取羊水15~20ml，注入无菌、带盖的离心管内，供羊水细胞培养用。8）、抽出羊水标本立即送至实验室进行培养。

二、羊水细胞培养：

1、离心（1000~1500r/min）5分钟。

2、无菌环境中，吸出上清液留作其它检验用。将剩下的0.5ml沉淀物轻轻打均。用无菌滴管吸取沉淀悬液，分别平铺于两个无菌羊水培养瓶内。

3、吸取F10培养液2.1ml和小牛血清0.9ml于羊水培养瓶内，轻轻摇匀，塞紧瓶塞放入37°C培养箱内静置培养。

4、换液，于培养6~7天，将羊水培养瓶置接种箱内，吸出（倒出）瓶内培养液，加入新鲜F10培养液2.1ml和小牛血清0.9ml，塞紧瓶塞。

5、倒置显微镜下观察细胞生长情况。如已贴壁生长，以后每天置倒置显微镜下观察一次。

6、当羊水瓶瓶壁布满圆形细胞或出现几个小岛布满许多圆形细胞。每个圆形细胞饱满，

边缘清晰，胞核清楚，内含丝状物。细胞肿胀似阿米巴原虫伸出的伪足，象要破裂似的。有的圆形细胞透亮，成双成对。此时羊水培养的细胞可以收获。一般9~12天可以收获。收获前视细胞生长情况更换新鲜培养液。

7、于培养终止前4~6小时，每个培养瓶中加入秋水仙素，最终浓度为2~3ug/ml放入

温箱继续培养。

三、制片：

1、细胞收获：将培养液移至离心管内，加EDTA-胰酶消化液2ml，置37 C恒温箱中5分钟，用滴管吸打3~4次，然后把消化液移到离心管中,再用0.85% NaCl 冲冼培养瓶内残留细胞,合并到离心管中。

2、离心（1000~1500r/min）6~7分钟，弃去上清液，留细胞沉淀0.2~0.3 ml加预温至370C低渗液(0.4%枸橼酸钠与0.4%KCI 1:1) 5滴以手指轻轻弹起或气泡冲匀加至5ml ,370C低渗5分钟。

3、预固定，加固定液(甲醇:冰醋酸为3:1) 7滴，轻轻用气泡冲匀，离心（1000~1500r/min）5分钟。

4、固定，弃去上清液，加固定液4ml 混匀，固定40分钟，离心弃去上清液；第二次固定，加固定液2ml，轻轻以气泡冲匀，固定20分钟。

5、滴片，离心（1000~1500r/min）5分钟，弃去上清液，加新鲜固定液3~4滴，气泡冲匀，滴片3张。标本放600C烤箱,烤16~24小时，即可进行显带。

四、影响培养成功的关键问题：

1、培养基PH值以6.8~6.9为宜，PH值低于6.4或高于7.0，细胞不易贴壁生长。

2、小牛血清建议用混合小牛血清，应在零下20度低温保存。

3、培养过程必须严格遵守无菌操作规程，防止培养物被污染。

4、每一步操作都要轻，离心时间不能太长，速度不能太快。

5、直观羊水中混有血液的标本可提前一天换液。

五、禁忌症：

1、孕周小于14周或大于24周的孕妇。

2、有稽留流产或先兆流产未治愈的孕妇。

3、有习惯性流产史孕妇的妊娠危险期。

4、有盆腔或宫腔感染的孕妇。

5、中央性前置胎盘或前置、低置胎盘有出血现象的孕妇。