生防真菌固体发酵
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
对照 1.09 1.19 1.13 1.09 1.19 1.13 1.09 1.19 1.13
润湿剂润湿性的测定结果
浓度（％） 0.0 重复 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 润湿时间（秒） 240 247 253 108 113 105 93 87 95 100 94 105
0.5
不同载体对盾壳霉水浴活率的影响
100 A 80
© £ £ ¹¹¹¹£ ¨¥
A B B C
60 40 20 0
è¹¹ ¹ ¹¹¹ ¹¹
¹¹° ° ¹¹
¹¹
微量元素增效剂的筛选
种类：硼酸、蔗糖、硫酸锌、氯化钙、 氯化钾、硫酸镁 评价指标：稀释5、10、50、100 ppm, 在WA培养基上，24 h、36 h别看其对盾 壳霉分生孢子的萌发率的差异
Ê (%) ö Â À Í Ë
紫外线保护剂的筛选结果(保护效果)
处理 浓度（％） 保护效能指数 荧光素钠 0.05 －0.19 I 0.10 －0.12 H 0.20 －0.09 G 抗坏血酸 0.05 0.47 C 0.10 1.12 B 0.20 1.14 A 核黄素 0.05 0.02 F 0.10 0.06 E 0.20 0.15 D
可湿性粉剂
制造成本较低
效果稳定
盾壳霉简介
盾壳霉制剂研究
商品名称 防治对象 向日葵菌核病 大田作物菌核病 温室及园艺作物 菌核病
国家
俄罗斯 Coniothyrin 德国、 Contans® 瑞士 匈亚利 KONI
本项研究的目的
探讨利用废弃的油菜秸秆培养盾壳霉的 可行性 制备盾壳霉可湿性粉剂 检验盾壳霉的防病效果
1.0
2.0
载体的筛选
考查指标（参照王成树等）
与盾壳霉的相容性
对盾壳霉分生孢子萌发的影响
对盾壳霉菌丝生长速率的影响
对盾壳霉分生孢子存活的影响
载体的筛选结果（孢子萌发）
载体种类 凹凸棒土 高岭土 对照 膨润土 硅藻土 珍珠岩 陶土 碳酸钙 白碳黑 浓度（％） 5 5 0 5 5 5 5 5 5 孢子萌发率（％） 49.6 a 47.6 a 46.8 a 46.8 a 46.0 a 44.8 a 44.1 a 43.6 a 0.0 b
48h萌发率 90.2 A 91.3 A 92.5 A 92.1 A 91.6 A
外加C源对分生孢子产量的影响
产量（107 个/g干基质）
150 120 90 60 30 0
可 溶 性 淀 粉
a
a
a
a b
a
麦 芽 糖
葡 萄 糖
蔗 糖
乳 糖
对 照
小结
不同菌株产孢量不同。 菌株Chy-1产孢量、48h孢子 萌发率最高；水浴处理及紫外线处理的孢子活率较其 他菌株好 水分对孢子产量的影响，以 1:3-1:6产量无差别，大于 1:6.5孢子产量下降；以 1:3-1:5水浴处理活孢率最高 发酵周期以12d为宜 接种量对孢子产量影响不大 可溶性淀粉、葡萄糖是较好的外加C源；外加N源以酵 母粉最好
油菜收获后，秸秆背废弃在田间地头
固体发酵方法
烘干的油菜秸秆粉碎（2 cm)，在500 ml三角瓶加 不同的营养成分及水份，浸泡12 h后灭菌。接种 盾壳霉分生孢子悬浮液，20℃培养15 d，水洗、 离心得分生孢子
研究内容
油菜秸秆培养盾壳霉的条件优化
以产孢量、孢子萌发率、存活性为指标
筛选菌株 确定基质含水量 确定接种量 确定外源营养物质的 确定发酵周期
A B C D A
A
Á 109 ) ý (¡ ö Ê ×¸ ß Ó æ
0d 6d 9d 12d 16d 19d
à Ñ Å ø Ì ì Ê ý
不同培养时间得到的孢子萌发率差异
发酵天数 6d 9d 12d 16d 19d
P<0.01
24h萌发率 86.2 A 85.9 A 85.3 A 70.5 B 71.5 B
A
A A B C
Chy-1
ZS-1
Sv-5-2
菌株
Sv-10-1 V-250-1
水分对产孢量的影响（每10g干料）
© Ê £ ù Ö Ë » Á 10 8 ¸ ¨¡ Ó /¿ ¿ £ ß × ú Á ² ö æ
8 6 4 2 0 30 40
A A
A A
B
B
50
60
65
70
® · Ë Ý º ¬ Á ¿ £ ¨g)
微量元素增效剂的筛选结果
处理 浓度(ppm) 孢子萌发率（24h,％） 孢子萌发率（48h,％）
硫酸锌
5 10 50 100
CK
65.2 BC 72.5 AB 73.4 A 78.0 A 58.7 C
74.7 a 74.2 a 75.7 a 77.4 a 73.2 aBiblioteka Baidu
P<0.05或0.01
紫外线保护剂的筛选
表面活性剂的筛选
考查指标
与盾壳霉的相容性
对盾壳霉分生孢子萌发的影响
对盾壳霉菌丝生长速率的影响
润湿分散性
表面活性剂的筛选结果（分散剂）
表面活性剂 木质素磺酸钙 浓度（ppm）
125 250 500 1000 125 250 500 1000 125 250 500 1000 125 250 500 1000
孢子萌发
++ ++ + + + + + + + + -
菌丝生长
+ ++ ++ ++ + + ++ ++ + + + + + +
木质素磺酸钠
拉开粉
NNO
表面活性剂的筛选结果（润湿剂）
湿润剂
十二烷基磺 酸钠
浓度（ppm） 孢子萌发
25 50 100 200 + + + -
菌丝生长
+ + -
十二烷基硫 酸钠
25 50 100 200
+ + -
-
分散剂分散力的测定
浓度(%) 处理时间 (h) 分散剂 木质素磺酸钙 木质素磺酸钠 0.0125 0 0.93 0.83 1 1.09 1.04 4 1.12 1.08 0.0250 0 0.45 0.25 1 0.51 0.30 4 0.63 0.56 0.0500 0 0.37 0.21 1 0.46 0.19 4 0.58 0.28
粘着剂的筛选结果
60 50
菌落形成单位(个/皿)
A A B B A A B C B A
花瓣 叶片
40 30 20 10 0
胶
粉
钠
糖
原
淀
素
蔗
黄
性
溶
可
羧
甲
基
纤
维
对
照
小结
盾壳霉可湿性粉剂配方
有效成份分生孢子数(>108/g) 十二烷基苯磺酸钠(1-1.5%) 木质素磺酸钙或钠(5-10%) 黄原胶(1%) 孢子萌发促进剂(0.1%) 抗坏血酸(10%) 硅藻土（补100%）
研究内容
分生孢子菌剂的制备及存活期的测定
可湿性粉剂的制备
表面活性剂、载体、粘着剂、孢子萌发促进剂、 紫外线保护剂的筛选
制剂存活期的测定
菌剂的防病效果评价
技术路线
发酵配方筛选 分生孢子的提取和干燥 菌剂制备 加工检测 药效试验和储存试验
不同菌株产孢量测定
孢子产量（107个/克干基质）
400 300 200 100 0
盾壳霉 可湿性 粉剂样 品
发 酵 前 秸秆中的营养可以满足盾 壳霉产生分生孢子的需要
发 酵 后
培养料的优势：价廉、通气性好（不板结）
菌剂制备试验方案
提取和干燥孢子 筛选菌剂添加物 混合和粉碎菌剂 分析菌剂质量
活孢子数、水分、悬浮率、润湿时间
测定菌剂有效存活期
研究内容
可湿性粉剂的成分
表面活性剂 紫外线保护剂 粘着剂 孢子萌发促进剂（微量元素增效剂） 载体
生防菌固体发酵及菌剂研制
-以盾壳霉为例
昆虫生防真菌的工业发酵方法
我国的双向发酵生产分 生孢子工艺 尚未形成知名产品
气垫式生产分生孢子（前捷克斯洛伐克）
绿僵菌生产车间
Itaforte 公司
Usina Univalem公司
Sao Martinho 公司
固相三级扩大发酵
我国上世纪70年代的 固相三级扩大发酵
载体的筛选结果（菌丝生长速率)
载体种类 硅藻土 陶土 高岭土 CK 凹凸棒土 珍珠岩 碳酸钙 膨润土 白碳黑 浓度（％） 菌丝生长速度 （mm/d） 5 3.28 a 5 3.24 a 5 3.20 ab 0 3.10 ab 5 2.96 bc 5 2.52 cd 5 2.40 de 5 2.06 f 5 0.00 g
粘着剂的筛选
种类：黄原胶、羧甲基纤维素钠、蔗糖、可 溶性淀粉 步骤：0.05％的粘着剂母液＋盾壳霉孢子悬 浮液分别对油菜花瓣和叶片喷雾，4h后取同 一高度的花瓣（30朵）和叶片（6片，打孔 取30片）在100ml无菌水中研磨，稀释后涂 选择性培养基（农利灵＋青霉素＋链霉素） 4天后调查孢子的萌发。
油菜秸秆发酵的改进（王爱琴的研究）
粉碎秸秆+添加麸皮及玉米粉
在耐高温塑料袋中发酵 将来还要过度到敞开发酵
√最后，研究了以油菜秸秆为主要原料培养盾壳霉分生孢子的 技术
油菜收获后秸秆被废弃， 或作为煮饭的燃料烧掉
将秸秆粉碎，添加少量玉米粉和麸皮，即可培养 盾壳霉。产量达到109 分生孢子/g
种类：荧光素钠（YG)、核黄素（VB2)、 抗坏血酸（VC）
评价指标： 对盾壳霉分生孢子萌发的影响 保护效果的验证（参照应盛华等《白僵 菌乳悬剂的配方筛选》）
盾壳霉分生孢子对紫外线的敏感测定
100 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120 300
Õ É ä Ê ±ä ¼ (s)
前人研究
固体发酵优点
类似于真菌的自然生活方式
有利于产物的获得和干燥。
抗紫外线以及抗干燥能力 存活期长
前人研究
盾壳霉固体发酵的例证
大麻秸秆＋外源营养
9×1014个盾壳霉分生孢子/立方米
燕麦
6×1014个分生孢子/立方米
前人研究
真菌制剂剂型
可湿性粉剂、油剂、悬浮剂
质量比油剂和悬浮剂易控制
接种量不同对产孢量的影响
接种量（ ×10⁶/ 瓶） 5 26 52 130 260 孢子产量（ ×10⁸/克） 4.45 a 3.39 a 2.81 a 2.73 a 2.75 a
P<0.05
发酵周期的确定
16 12 8 4 0
» Í ² ¬ Å à Ñ ø Ê ±¼ ä µ Ä · Ö É ú æ ß × Ó ² ú Á ¿
润湿剂润湿性的测定结果
浓度（％） 0.0 重复 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 润湿时间（秒） 240 247 253 108 113 105 93 87 95 100 94 105
0.5
不同载体对盾壳霉水浴活率的影响
100 A 80
© £ £ ¹¹¹¹£ ¨¥
A B B C
60 40 20 0
è¹¹ ¹ ¹¹¹ ¹¹
¹¹° ° ¹¹
¹¹
微量元素增效剂的筛选
种类：硼酸、蔗糖、硫酸锌、氯化钙、 氯化钾、硫酸镁 评价指标：稀释5、10、50、100 ppm, 在WA培养基上，24 h、36 h别看其对盾 壳霉分生孢子的萌发率的差异
Ê (%) ö Â À Í Ë
紫外线保护剂的筛选结果(保护效果)
处理 浓度（％） 保护效能指数 荧光素钠 0.05 －0.19 I 0.10 －0.12 H 0.20 －0.09 G 抗坏血酸 0.05 0.47 C 0.10 1.12 B 0.20 1.14 A 核黄素 0.05 0.02 F 0.10 0.06 E 0.20 0.15 D
可湿性粉剂
制造成本较低
效果稳定
盾壳霉简介
盾壳霉制剂研究
商品名称 防治对象 向日葵菌核病 大田作物菌核病 温室及园艺作物 菌核病
国家
俄罗斯 Coniothyrin 德国、 Contans® 瑞士 匈亚利 KONI
本项研究的目的
探讨利用废弃的油菜秸秆培养盾壳霉的 可行性 制备盾壳霉可湿性粉剂 检验盾壳霉的防病效果
1.0
2.0
载体的筛选
考查指标（参照王成树等）
与盾壳霉的相容性
对盾壳霉分生孢子萌发的影响
对盾壳霉菌丝生长速率的影响
对盾壳霉分生孢子存活的影响
载体的筛选结果（孢子萌发）
载体种类 凹凸棒土 高岭土 对照 膨润土 硅藻土 珍珠岩 陶土 碳酸钙 白碳黑 浓度（％） 5 5 0 5 5 5 5 5 5 孢子萌发率（％） 49.6 a 47.6 a 46.8 a 46.8 a 46.0 a 44.8 a 44.1 a 43.6 a 0.0 b
48h萌发率 90.2 A 91.3 A 92.5 A 92.1 A 91.6 A
外加C源对分生孢子产量的影响
产量（107 个/g干基质）
150 120 90 60 30 0
可 溶 性 淀 粉
a
a
a
a b
a
麦 芽 糖
葡 萄 糖
蔗 糖
乳 糖
对 照
小结
不同菌株产孢量不同。 菌株Chy-1产孢量、48h孢子 萌发率最高；水浴处理及紫外线处理的孢子活率较其 他菌株好 水分对孢子产量的影响，以 1:3-1:6产量无差别，大于 1:6.5孢子产量下降；以 1:3-1:5水浴处理活孢率最高 发酵周期以12d为宜 接种量对孢子产量影响不大 可溶性淀粉、葡萄糖是较好的外加C源；外加N源以酵 母粉最好
油菜收获后，秸秆背废弃在田间地头
固体发酵方法
烘干的油菜秸秆粉碎（2 cm)，在500 ml三角瓶加 不同的营养成分及水份，浸泡12 h后灭菌。接种 盾壳霉分生孢子悬浮液，20℃培养15 d，水洗、 离心得分生孢子
研究内容
油菜秸秆培养盾壳霉的条件优化
以产孢量、孢子萌发率、存活性为指标
筛选菌株 确定基质含水量 确定接种量 确定外源营养物质的 确定发酵周期
A B C D A
A
Á 109 ) ý (¡ ö Ê ×¸ ß Ó æ
0d 6d 9d 12d 16d 19d
à Ñ Å ø Ì ì Ê ý
不同培养时间得到的孢子萌发率差异
发酵天数 6d 9d 12d 16d 19d
P<0.01
24h萌发率 86.2 A 85.9 A 85.3 A 70.5 B 71.5 B
A
A A B C
Chy-1
ZS-1
Sv-5-2
菌株
Sv-10-1 V-250-1
水分对产孢量的影响（每10g干料）
© Ê £ ù Ö Ë » Á 10 8 ¸ ¨¡ Ó /¿ ¿ £ ß × ú Á ² ö æ
8 6 4 2 0 30 40
A A
A A
B
B
50
60
65
70
® · Ë Ý º ¬ Á ¿ £ ¨g)
微量元素增效剂的筛选结果
处理 浓度(ppm) 孢子萌发率（24h,％） 孢子萌发率（48h,％）
硫酸锌
5 10 50 100
CK
65.2 BC 72.5 AB 73.4 A 78.0 A 58.7 C
74.7 a 74.2 a 75.7 a 77.4 a 73.2 aBiblioteka Baidu
P<0.05或0.01
紫外线保护剂的筛选
表面活性剂的筛选
考查指标
与盾壳霉的相容性
对盾壳霉分生孢子萌发的影响
对盾壳霉菌丝生长速率的影响
润湿分散性
表面活性剂的筛选结果（分散剂）
表面活性剂 木质素磺酸钙 浓度（ppm）
125 250 500 1000 125 250 500 1000 125 250 500 1000 125 250 500 1000
孢子萌发
++ ++ + + + + + + + + -
菌丝生长
+ ++ ++ ++ + + ++ ++ + + + + + +
木质素磺酸钠
拉开粉
NNO
表面活性剂的筛选结果（润湿剂）
湿润剂
十二烷基磺 酸钠
浓度（ppm） 孢子萌发
25 50 100 200 + + + -
菌丝生长
+ + -
十二烷基硫 酸钠
25 50 100 200
+ + -
-
分散剂分散力的测定
浓度(%) 处理时间 (h) 分散剂 木质素磺酸钙 木质素磺酸钠 0.0125 0 0.93 0.83 1 1.09 1.04 4 1.12 1.08 0.0250 0 0.45 0.25 1 0.51 0.30 4 0.63 0.56 0.0500 0 0.37 0.21 1 0.46 0.19 4 0.58 0.28
粘着剂的筛选结果
60 50
菌落形成单位(个/皿)
A A B B A A B C B A
花瓣 叶片
40 30 20 10 0
胶
粉
钠
糖
原
淀
素
蔗
黄
性
溶
可
羧
甲
基
纤
维
对
照
小结
盾壳霉可湿性粉剂配方
有效成份分生孢子数(>108/g) 十二烷基苯磺酸钠(1-1.5%) 木质素磺酸钙或钠(5-10%) 黄原胶(1%) 孢子萌发促进剂(0.1%) 抗坏血酸(10%) 硅藻土（补100%）
研究内容
分生孢子菌剂的制备及存活期的测定
可湿性粉剂的制备
表面活性剂、载体、粘着剂、孢子萌发促进剂、 紫外线保护剂的筛选
制剂存活期的测定
菌剂的防病效果评价
技术路线
发酵配方筛选 分生孢子的提取和干燥 菌剂制备 加工检测 药效试验和储存试验
不同菌株产孢量测定
孢子产量（107个/克干基质）
400 300 200 100 0
盾壳霉 可湿性 粉剂样 品
发 酵 前 秸秆中的营养可以满足盾 壳霉产生分生孢子的需要
发 酵 后
培养料的优势：价廉、通气性好（不板结）
菌剂制备试验方案
提取和干燥孢子 筛选菌剂添加物 混合和粉碎菌剂 分析菌剂质量
活孢子数、水分、悬浮率、润湿时间
测定菌剂有效存活期
研究内容
可湿性粉剂的成分
表面活性剂 紫外线保护剂 粘着剂 孢子萌发促进剂（微量元素增效剂） 载体
生防菌固体发酵及菌剂研制
-以盾壳霉为例
昆虫生防真菌的工业发酵方法
我国的双向发酵生产分 生孢子工艺 尚未形成知名产品
气垫式生产分生孢子（前捷克斯洛伐克）
绿僵菌生产车间
Itaforte 公司
Usina Univalem公司
Sao Martinho 公司
固相三级扩大发酵
我国上世纪70年代的 固相三级扩大发酵
载体的筛选结果（菌丝生长速率)
载体种类 硅藻土 陶土 高岭土 CK 凹凸棒土 珍珠岩 碳酸钙 膨润土 白碳黑 浓度（％） 菌丝生长速度 （mm/d） 5 3.28 a 5 3.24 a 5 3.20 ab 0 3.10 ab 5 2.96 bc 5 2.52 cd 5 2.40 de 5 2.06 f 5 0.00 g
粘着剂的筛选
种类：黄原胶、羧甲基纤维素钠、蔗糖、可 溶性淀粉 步骤：0.05％的粘着剂母液＋盾壳霉孢子悬 浮液分别对油菜花瓣和叶片喷雾，4h后取同 一高度的花瓣（30朵）和叶片（6片，打孔 取30片）在100ml无菌水中研磨，稀释后涂 选择性培养基（农利灵＋青霉素＋链霉素） 4天后调查孢子的萌发。
油菜秸秆发酵的改进（王爱琴的研究）
粉碎秸秆+添加麸皮及玉米粉
在耐高温塑料袋中发酵 将来还要过度到敞开发酵
√最后，研究了以油菜秸秆为主要原料培养盾壳霉分生孢子的 技术
油菜收获后秸秆被废弃， 或作为煮饭的燃料烧掉
将秸秆粉碎，添加少量玉米粉和麸皮，即可培养 盾壳霉。产量达到109 分生孢子/g
种类：荧光素钠（YG)、核黄素（VB2)、 抗坏血酸（VC）
评价指标： 对盾壳霉分生孢子萌发的影响 保护效果的验证（参照应盛华等《白僵 菌乳悬剂的配方筛选》）
盾壳霉分生孢子对紫外线的敏感测定
100 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120 300
Õ É ä Ê ±ä ¼ (s)
前人研究
固体发酵优点
类似于真菌的自然生活方式
有利于产物的获得和干燥。
抗紫外线以及抗干燥能力 存活期长
前人研究
盾壳霉固体发酵的例证
大麻秸秆＋外源营养
9×1014个盾壳霉分生孢子/立方米
燕麦
6×1014个分生孢子/立方米
前人研究
真菌制剂剂型
可湿性粉剂、油剂、悬浮剂
质量比油剂和悬浮剂易控制
接种量不同对产孢量的影响
接种量（ ×10⁶/ 瓶） 5 26 52 130 260 孢子产量（ ×10⁸/克） 4.45 a 3.39 a 2.81 a 2.73 a 2.75 a
P<0.05
发酵周期的确定
16 12 8 4 0
» Í ² ¬ Å à Ñ ø Ê ±¼ ä µ Ä · Ö É ú æ ß × Ó ² ú Á ¿