固体发酵与液体发酵生产纤维素酶产率与催化性能比较_段金柱

14 .9 2 .5
1.295 0.251
注 :SSF :固体发酵 ;LSF:液体发酵 。
2.3 2 种发酵工艺酶液的组分酶比例分析 我们分析了同一菌株 2 种发酵工艺最佳发酵时
间的总酶活与组分酶活 , 以组分酶与总酶活发酵单 位相比 , 结果如表 3 所示 。
表 3 2 种发酵工艺酶液组分酶组成
CS
640
6 .906
11 .275
0.615 6
注 :FP(滤纸酶活)
从表 3 可以看到 :液体发酵不仅酶产量低 , 各组
分酶的比例也较固体发酵低 , SDS -聚丙烯酰 胺凝
胶电泳图谱比较分析 , 见示意图 2 , 2 种发酵方式产
生的酶液有 4 条带深浅宽窄上相似 , 液体发酵与固
体发酵共有的另 6 条带颜色浅 , 不明显 , 并且较固体
关键词 固体发酵 ;液体发酵 ;纤维素酶 中图分类号 TQ 924 The Compare of SSF and LSF with Trichodema Viride for Cellulase Production in Yield and Catalysis Property ABSTRACT With two different carbon sources, solid -state fermentation(SSF)and liquid-state fermentation(LSF)with Trichodema viride for cellulase production were compared .The cellulase yield of 742～ 827 U/ g of substrate in SSF was increased by 25 % compared with the yield of 640～ 663 U/ g of substrate in LSF , in which endo -1, 4 -β -D -glucanase , exo -1, 4 -β -D-glucanase and β -glucosidase were incresed by 28 %, 42% and 49 % respectively .The ratio of enzyme components was also higher in SSF .Four bands were lost on SDS -polyaceglamide electrophoretogram of enzyme produced by LSF .And the saccharification of enzyme by SSF was higher than LSF .In respect to LSF , SSF has advantages of lower cost and higher production . KEYWORDS SSF ;LSF ;cellulase enzyme
糖化率 %=增加基的质糖重量量×0 .9 ×100 % 1.5 SDS -聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳
浓缩胶质量分数为 3 %, 分离胶质量分数为 10 %。 样品蛋白均浓缩至2 .0 mg/ml 。
2 结果与分析 2.1 2 种碳源固体发酵(SSF)与液体发酵曲线比较
从发酵曲线对比(图 1)可见 , 固体发酵时间短 ,
结果显示 , 由于稻草未经灭菌处理 , 在糖化实验 中 , 24 h内 , 糖化率迅速增加 , 之后却由于微 生物生 长对糖的消耗 , 糖化率呈现下降趋势 , 但相同基质浓 度下 , 不同时间 ,SSF 均表现出比 LSF 较高的糖化能 力。
3 讨论 2 种发酵工艺相比较而言 , 液体发酵节 省劳动
2 4 粮食与饲料工业 2000 年 第 3 期
固体发酵与液体发酵生产纤维素酶 产率与催化性能比较
辽宁师范大学实验中心(116029) 段金柱 沈 阳农 业 大 学基 础 部(110161) 曹淡君
摘 要 对绿色木霉产纤维素酶固体发酵和液体发酵进行比较研究 , 结果显示 :固体 发酵产率(742 ～ 827 U/ g) 比液体发酵产率(640～ 663 U/ g)高 25 %, 其中 CI 酶提 高 28%, Cx 酶提高 42%,β-葡萄 糖苷酶提 高 49%, 且酶组份 比 例高 于液体发酵 。SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳图谱明显多出 4、5 条轻带 。 酶解 未经预处理 的稻草糖 化率也明显 高 于液体发酵 , 联系大规模生产进一步阐述了固体 发酵比液体发酵具有投入少 , 成本低 , 省能源等优势 。
作底物 , 测定一定时间糖化率如表 4 所示 。
发酵工艺 碳源 FP
酶活/U·g -1 Cl 酶/ FP Cx 酶/FP
β 酶/ FP
固体发酵 RS 827
8 .328
12 .725
0 .672
CS
718
8.389 9
13 .646
0 .125
液体发酵 RS 663
8 .15
10 .94
0.669 69
纤维素酶的发酵方法是纤维素酶生产中存在的 第 2 个关键问题(第 1 关键是菌种)。发酵方法可分 固体发酵与液体发酵 2 种 , 其中固体发酵的方法开 始在发展[ 1] , 固体发酵不含游离水 , 适宜木霉生长 , 并在设备 、耗能 、投资 、生产成本方面国内外许多工 厂的建立已说明比液体发酵优越得多 , 但对酶的产 率和品质比较方面尚少见报导 。因此本文用 2 种不 同碳源(稻草粉 RS 和玉米秸粉 CS)在这方面做了较 详细的工作 。
表 1 2 种发酵工艺最高发酵液酶活及 产率结果
发酵方式
Biblioteka Baidu
碳源
滤纸酶 FLEA/ U·ml -1 酶产率/ U·g -1
Cl 酶 FLEA/ U·ml -1 酶产率/ U·g -1
Cx 酶 FLEA/ U·ml -1 酶产率/ U·g -1
β-葡萄糖苷酶 FLEA/ U·ml-1 酶产率/ U·g -1
收稿日期 :1999 -10 -14 段金柱 , 男 , 辽宁师范大学实验中心 , 沈阳
第 3 期 2000 年 段金柱等 :固体发酵与液体发酵生产 纤维素酶产率与催化性能比较 25
可达到酶活最高 。
2.2 2 种发酵方法发酵液酶活及酶产率比较
从表 1 和表 2 可看出 , 同一菌种固体发酵酶产
率明显高于液体发酵 , 至少也可提高 16 %, 发酵后
固体发酵粗酶液酶活是液体发酵液酶活的 10 倍以
发酵单位(U/ g)以每克风干发酵基质所产生的酶活单位表示 图 1 2 种碳源 SSF 与 LSF 滤纸酶活发酵曲线
72 h便可以达到最高 , 而液体发酵时间长 , 6 ～ 7 d才
上 , 蛋白含量(G -250 考马斯亮兰法测定)固体发酵 粗酶液(约 72 %)比液体 发酵(最高约 28 %)高 2 .6 倍 。这使得固体发酵发酵液的后处理 , 即分离提取 、 浓缩相对液体发酵容易 。
表 2 2 种发酵工艺发酵液酶活及产 率比较
碳源
滤纸酶
FLEA
酶产率
Cl 酶
FLEA
酶产率
Cx 酶
F LEA
酶产率
β-葡萄糖苷酶
FLEA
酶产率
RS
12 .25
SSF 与 LSF 之比
CS
10 .57
1.247 1.159
12 .59 12 .80
1 .280 1 .362
14.25 12.95
1 .452 1 .420
LSF
基质/ 酶活 g·U -1
1∶20 1∶20 1∶20
1∶20
糖化率/ %
24 h 64 38 .2 -
48 h 43 .2 14 .4
-
-
72 h 32 .4 7 .7 11 .3 6 .3
2 6 粮食与饲料工业 2000 年 第 3 期
1.2.2 液体发酵培养基及培养方法 见参考文献[ 2] 。
1.3 纤维素酶活力测量 滤纸酶 、Cl 酶 、Cx 酶 、β-葡萄糖苷酶活力用 DNS
法测定还原糖生成量 , 每小时由底物产生1 μmol 葡 萄糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。 1.4 糖化率测定[ 3, 4]
底物为经粉碎过 20 目筛的风干稻草粉 , 将定量 底物 盛于125 ml 三角瓶中 , 加入50 ml含 有酶液(底 物 :酶活力 =1g/ 20 U)和苯甲酸钠(底物量的 0 .8 %) 的pH 4 .8 柠檬酸 缓冲 液 , 30 ℃保 温 , 酶解 终了 , 过 滤 , 取滤液适当稀释以 DNS 法测还原糖含量 。
力 、适合于大规模工业化生产 , 美 、日 、丹麦等发达国 家在这方面过去做得较多 , 后来 , 随着固体发酵生产 线的相继建成投产 , 以及市场竞争对低成本高产出 的迫切需求 , 固体发酵已日益受到注目 。 3.1 固体发酵无论是产量上还是质量上均优于液
体发酵 首先 , 固 体发酵比液体 发酵具有更 高的产率 , D .S .Chahal 通过对文献已报导的 2 种发酵工艺产率 的分析比较 , 发现固体发酵酶产率(250 ～ 430 IU/ g纤 维素)比液体发酵酶产率(160 ～ 250 IU/g纤维素)增 加约 72 %[ 4] 。本文以同一菌株实验表明 ;以滤纸酶 活表示的总酶活酶产率可提高 25 %, 其中 Cl 酶提高 28 %,Cx 酶提高 42 %, β-葡萄糖苷酶提 高 49 %。 是 由于目前国内外应用的产纤维素酶的菌种大多系真 菌 , 真菌习性在静止条件下生产 , 并要求菌丝体紧密 接触纤维素类物质 , 故而在液体搅 拌中生长不良 。 纤维素基质是不溶性的 , 亦不利于液体发酵 。 在液 体搅拌发酵中 , 真菌在发酵罐内只长菌丝体 , 真菌不 同部位分泌的酶的酶组分存在差异 , 故而液体发酵 酶组分没有生长完全的固体发酵酶组分丰富和比例 适当 。 3.2 2 种工艺在大规模生产方面比较 液体发酵的培养周期长 , 至少长达 7 ～ 8 d , 更多 的长达11 d以上[ 6] 。 大规模生产时 , 发酵罐 的搅拌 浆不停地搅拌耗能是相当巨大的 。 而固体发酵则不 需搅拌 , 且培养周期短 , 只培养3 d , 且在不含游离水 的条件下培养 , 水分为 75 %, 液体发酵水分较多(通 常 94 %～ 99 .5 %), 这使得后处理中 , 由于水多 , 分 离提取干燥时要多耗电能和蒸汽 , 需要效率更高的 设备 , 就我国目前设备与发达国家相比 , 尚有相当差 距 , 而如依赖进口 , 费用很高 。 在耗能方面 , 据研究 表明 , 液体发酵比固体发酵在同量基质条件下 , 多耗 电能 8 ～ 10 倍(蒸汽未计)[ 4] 。
发酵少 4 、5 条带 , 电泳图谱说明固体发酵产酶比液
体发酵有更多的谱带 。
2.4 糖化率比较
糖化率反映了纤维素酶分解纤维素 , 转化为葡
萄糖及纤维二糖的能力 。 以未经预处理 20 目稻草
图 2 电泳图谱 比较分析
表 4 2 种工艺酶液酶解糖化能力结果
基质浓度 %
发酵工艺
5
SSF
LSF
10
SSF
1 材料方法 1.1 实验材料
试验菌株为沈阳农业大学辽宁省酶工程中心提 供绿色木霉(Trichodema Viride)SN9706 , 发酵 基质为 粉碎过 20 目筛稻草粉或玉米秸粉 。 1.2 培养基及培养方法 1.2.1 固体培养方法
在饭盒中加入适量稻草粉和麸皮 , 再加入固体 培养液 , 搅拌均匀 , 灭菌 , 冷却后接种 12 %～ 15 %液 体种子 , 28 ～ 30 ℃培养3 d , 浸提 、挤压过滤得酶液 , 适当稀释测纤维素酶活性 。
固体发酵 RS
98
827
34
6 888
1 245
10 534
79
664
CS
92
742
32
6 024
1 268
10 248
13
99
液体发酵 RS CS
8 .0 8 .7
663 640
2.7
5 379
2.5
4 420
87 98
7 256
5 .3
7 216
5 .3
444 394
注 :发酵液酶活 FLEA(fermentation liquid enzyme activity):系发酵后酶液(固体发酵液为基质∶水 =1∶7 的浸提液)每 毫升在60 min内由底物 释 放的葡萄糖 μmol 数 ;酶产率以每克风干发酵基质所产生的酶活单位即发酵单位表示 :RS(rice straw 稻草粉);CS(com straw 玉米秸粉)。