纤维素酶

纤维素酶

班级：10生工一班学号：20100801132 姓名：张羽一．纤维素酶的简介：

hengno-CA型系列中性纤维素酶(粉剂)

纤维素酶（英文：cellulase）是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用。是可以将纤维素分解成多糖或单糖的蛋白质或RNA。由多种水解酶组成的一个复杂酶系，自然界中很多真菌都能分泌纤维素酶。习惯上，将纤维素酶分成三类：C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是对纤维素最初起作用的酶，破坏纤维素链的结晶结构。Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解β-1，4-糖苷键的纤维素酶。β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。纤维素酶种类繁多，来源很广。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。由于真菌纤维素酶产量高、活性大，故在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

二．所用微生物菌种：木霉。

木霉属于半知菌门，丝孢目，木霉属，常见的木霉有绿色木霉、康宁木霉等。木霉菌落开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展，后从菌落中央产生绿色孢子，中央变成绿色。菌落周围有白色菌丝的生长带。最后整个菌落全部变成绿色。绿色木霉菌丝白色，纤细，宽度为1.5～2.4微米。产生分生孢子。分生孢子梗垂直对称分歧，分生孢子单生或簇生，圆形，绿色。绿色木霉菌落外观深绿或蓝绿色；康氏木霉菌落外观浅绿、黄绿或绿色。木霉具有较强分解纤维素能力，绿色木霉通常能够产生高度活性的纤维素酶，对纤维素的分解能力很强。在木质素、纤维素丰富的基质上生长快，传播蔓延迅速。棉籽壳。木屑、段木都是其良好的营养物。

培养基配方（保藏、活化、种子扩大、发酵生产）纤维素酶菌种易退化，退化后其产酶力明显降低，其原因可能有三个方面：①经诱变筛选的菌种发生回复突变。②自然负突变。③菌

种长时间低温斜面保藏，会在分生孢子上长出次生菌丝，而次生菌丝所形成的分生孢子生命力弱，这可能是菌种退化的主要原因。为了避免纤维素酶菌种退化，可采用砂土管保藏菌种。即将过筛洗净的砂子与土以3：2比例混合分装在试管内，用1kg/cm2压力灭菌30分钟共三次，将欲保存的斜面菌种制备成1000ml孢子悬浮液，每个砂土管注入0.5ml，摇匀，放入盛有无水CaCl2真空干燥器内保存。活化只需恢复常温即可。

三．纤维素的生产：

影响纤维素酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等。这些因素不是孤立的，而是相互联系的。一，以绿色木霉（T.ViriclePers.expr）为菌种，考虑到影响产纤维素酶的五大因素对产酶量和活力的作用，则需基质粗纤维含量为40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31℃条件下培养45h可获得最大产酶量26mg/g和CMC 酶活力20mg/g·h,二，而里氏木霉91-3的产酶条件是该菌种以7：3的秸秆粉和麦麸，另添加4%硫酸铵、0.4%磷酸二氢钾、0.1%硫酸镁为最佳培养基，28-32℃为适宜培养温度，30℃为最佳温度，4%为最佳接种量，96h到达发酵高峰,三，以康氏木霉W-925为出发菌，经诱变后得到的Wu-932纤维素酶高产菌的最佳发酵条件。以1：2的麦麸和稻草粉为培养基，5%的接种量，稻草粉碎平均长度3-5mm，初始pH4-5，温度在28-35℃，发酵时间72h为最佳发酵条件。

四．纤维素酶的分离纯化方法：

粗酶液的制备: 取发酵液于4 ℃,8000rpm, 离心15 分钟, 收集上清夜即为粗酶液。测定粗酶液中纤维素酶活, 蛋白质含量。

硫酸铵沉淀和透析: 取粗酶液, 加入硫酸铵至25% 饱和度,4 ℃,10000rpm, 离心10 分钟, 分别测沉淀物和上清液中的酶活, 酶活集中于沉淀物中, 收集沉淀物溶于少量0.05 ｍｏｌ/ ＬＰｈ6.0 磷酸缓冲液中, 透析除盐, 得到经硫酸铵沉淀的纯化酶液, 此为分子筛柱层析上样样品。

葡聚糖凝胶层析葡聚糖凝胶SephadexG-100；SephadexG-75；SephadexG-50, 充分溶胀, 抽气, 分别装柱(50cm×2.6cm), 用0.05ｍｏｌ/ ＬｐＨ6.0 磷酸缓冲液充分平衡后上样, 选择合适的流速、检验器灵敏度，测定出现吸收峰各管的纤维素酶活及蛋白含量。根据不同凝胶的层析图谱判定最适的一种。 2.3.4 SDS-SPGE 采用垂直板式不连续系统电泳, 分离胶浓度12%, 浓缩胶浓度4%, 用0.25%( Ｗ/ Ｖ) 考马斯亮蓝Ｒ-250 酸性乙醇水染色。

五．纤维素酶活力的测定：

1.以滤纸酶活和羧甲基纤维素钠酶活为测定指标。

FPA活力的测定：取适量稀释的酶液0.5ml加入1mlph值4.8的柠檬酸。磷酸氢二钠缓冲液，加入滤纸条一片，在50℃酶解30min，然后进行DNS还原糖测定，最后再扣除发酵液

中的还原糖含量，再算出酶活。

CMCA活力的测定：取1%的羟甲基纤维素钠1ml作为底物，加入1ml适量稀释的纤维素酶溶液，于特定条件下反应30min后，用DNS法测定还原糖，并扣除空白试验测定值。

2.还原糖测定

采用3,5二硝基水杨酸法：DNS试剂与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，其产物在煮沸后显色，其颜色深度与还原糖的含量成线性关系，利用分光光度计测量还原糖。

3.出发菌株的筛选

将-80℃保存的里氏木霉YZ-68接种到斜面培养基上，连续传代3次，活化菌种。将活化的菌种稀释后涂布在筛选平板上，观察菌株的生长情况，利用透明圈的大小，选取透明圈大的菌株单菌落作为诱变的出发菌株。

六．参考文献：

王菁莎;纤维素酶的制备及玉米秸秆固态发酵酒精的研究[D];河北农业大学;2006年

2012年9月3日