土壤纤维素酶测定方法

纤维素酶活性测定

一、试剂：

1）醋酸缓冲液（pH 5.5）：164.08 g无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于700 ml去离子水，用醋酸（C2H4O2）调节pH至5.5，用去离子水稀释至1 L。

2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液，45℃下搅拌2 h，此溶液在4℃下可存放7天。

3）还原糖试剂：

试剂A：16 g无水碳酸钠（Na2CO3）和0.9 g氰化钾（KCN）溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B：0.5 g六氰铁钾（K4Fe（CN）6）溶于去离子水并稀释至1 L，贮于棕色瓶中。

试剂C：1.5 g 硫酸铁铵（NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O）、1 g十二烷基硫酸钠（C12H25O4SNa）和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水，冷却后稀释至1 L。

4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中，并定容至1 L。

二、仪器设备

恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，搅拌器，三角瓶

三、操作步骤

取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鲜土壤（＜2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液，盖上塞子，于50℃下培养24 h，过滤。同时做空白对照，但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液，并迅速过滤。

取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中，并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中，加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B，盖紧混匀，在100℃水浴中加热15 min 后，立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C，混匀，20℃下静置显色60 min，于690 nm波长处比色测定（要求在30 min内完成）。

标准曲线：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去离子水稀释至2 ml，同上加入还原糖试剂A、B、C后，比色测定还原糖含量。c) 空白：

无土空白：不加土样，其余操作与样品试验相同，整个试验设置一个，重复一次。

无基质空白：以等体积水代替基质，每个土样设置一个。

四、结果计算

土壤纤维素酶活性（µg·g-1·(24 h)-1）＝(C*V*f)/ dwt

式中C为样品的葡萄糖含量（µg·ml-1）；V为土壤溶液体积（30 ml）；f为稀释倍数（25）；dwt为烘干土壤质量（g）

五、注意事项

（1）此方法较适用于林地土壤，耕地土壤的测定结果一般较低。

（2）氰化钾为剧毒试剂，接触皮肤的伤口或吸入微量粉末即可中毒死亡。与酸接触分解能放出剧毒的氰化氢气体，与氯酸盐或亚硝酸钠混合能发生爆炸。

（3）盐分、铵离子、银、草酸锰、氧化物以及氟等含量较高时，会干扰葡萄糖的测定。因此，建议稀释滤液。

（4）培养时加甲苯与不加甲苯的测定结果一般没有显著性差异。

（5）测定还原糖时需严格控制体系的pH值，加入还原糖试剂A和还原糖试剂B 后，pH 值应该高于10.5，加入还原糖试剂C之后，pH值则应低于2。

（6）含氰化物的溶液可以在碱性条件下用H2O2氧化处理，或者加入强碱性次氯酸盐，反应24小时后，再用大量水冲入废水系统。