纤维素酶活力的测定

β-糖苷酶活力的测定（CMC）

一目的：

掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。

原理：

纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中分解出还原糖，还原糖又同3，5-而硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，用分光光度计可测定其色度，计算酶活力。

二试剂：

1．3，5-而硝基水杨酸显色剂（又称DNS试剂）：称取10g3,5-而硝基水杨酸，溶于蒸馏水中，加入20g分析纯NaOH，200g酒石酸钾钠，加税500ml,升温溶解后，加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠0.5g,加热搅拌，待全部溶解后，定容至1000ml。贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后使用。

2．0.1mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液：称取结晶醋酸钠（CH3COONa.3 H2O）13.61g，醋酸（CH3COOH）6.00g，用蒸馏水溶解，并定容至1000 ml，配好后用pH计矫正。

3．1mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70℃、600nm汞柱下干燥5h至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml，冰箱中保存备用。

4．代测酶液：称取酶粉1.0g（或吸取酶液1.00ml），先用少量的0.05mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加上述缓冲液溶解，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，40℃水浴锅中浸提1h，用四层纱布或脱脂

棉过滤，滤液供测定用。

5．底物：0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，配制方法为城区0.5000g 羧甲基纤维素钠（Sigma公司生产），准确至0.001g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存，有效期3d。

三仪器：

分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。

四方法步骤：

1．标准曲线的绘制

分别吸取0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4ml的1mg/ml葡萄糖液于7支20ml的比色管中，分别用蒸馏水补充体积至2.oml,各加3，5-而硝基水杨酸1.5ml,在沸水浴中煮沸5min，冷却后分别用蒸馏水定容至20ml，摇匀。以2ml蒸馏水加DNS溶液1.5ml,按上述同样操作为空白调零，在540nm处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体积见下表。以吸光度A值为纵坐标，葡萄糖毫克数W(mg)为横坐标绘制出标准曲线（理论上此线应过原点）。

标准曲线绘制各试管所含物质的体积

2．酶样测定

取20ml比色管1支，加入0.5mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液1.5ml 和6小片1cm×1cm滤纸后，再加适当稀释的酶液0.5ml,于40℃下保温1h后，再加适当稀释的酶液0.5ml，于40℃下保温1h后，加DNS液

1.5ml,在沸水煮沸5min显色，流水冷却，用蒸馏水定容至20ml,摇匀；

另取一支试管，加缓冲液和滤纸后，先加DNS液，再加缓冲液0.5ml,同样显色、冷却、定容作为空白，在波长540nm比色，测定A值，查标准曲线得出相应的葡萄糖含量W。

五计算

酶的比活力定义：在40℃，pH4.5条件下，每小时催化滤纸产生相当于1ug 分子葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位，以U/g表示。

W×1000×n

X = -----------

0.5×180×30

式中，X----样品酶的活力，U/g(ug/ml);

W----查标准曲线得出相应的葡萄糖含量，mg;

1000----mg换算成ug的换算系数；

0.5----吸取酶液的量，ml；

180----葡萄糖分子量；

n----稀释倍数；

30----反应时间，min。