斑鼻羚毛首线虫ITS序列的PCR扩增及分析

要是 由于分类 定种 标 准未 统 一 ， 之 取 自不 同地 区、 加 不同宿主体 内 的虫 体存 在 差 异 。随着 生物 化学 技 术 的发展和分子遗 传学 方 法在 寄 生 虫分类 学 中 的广 泛 应用 ， 多学者 为阐明毛首线 虫属 的分类 体系 进行 了 众 不同 的研 究 ， 点 就 在 于 选 取 稳 定 可 信 的遗 传 标 重
产物 转化 至感 受态 细胞 Ｊ Ｏ Ｍｌ ９中 ， 在含 氨苄 青霉 素 和 ＩＴ 的 Ｌ Ｐ Ｇ Ｂ平 板 上 无 菌挑 选 白色 的单 菌 落 ， 培 养菌 落 ， 进 行 菌 液 Ｐ Ｒ鉴定 ， 至筛 选 获得 阳性 并 Ｃ 直
克隆 。
有限公 司合成 的保 守引物序列 如下 ：
动 物 医 学 进 展 。 ０ ｌ ３ （ ） ４ —Ｏ ２ １ ， ２ ３ ： ７５
Ｐｒ ｇｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉ ｉ ｏ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
斑鼻羚毛首线虫 Ｉ ＴＳ序 列 的 Ｐ Ｒ 扩增 及 分 析 Ｃ
任 娣 陈 武 宋 亚芬 袁 子 国 ， ， ， ， 朱兴 全。 林 瑞 庆 ，
０ ５ｍｏ ／ Ｅ ． ｌＬ ＤＴＡ （ｐ ．０） ０ “ Ｈ８ ，５ Ｌ；４ ｍｇ ｍＬ ／
ＲＮａ ｅＡ ｏ ｕ ｉｎ， ｘ ２ ／ ｒ ｔｉ ａ ｅ Ｋ， ｓ ｓ ｌｔｏ ５ ｆ Ｌ； ０ ｍｇ ｍＬ Ｐ ｏ ｅｎ ｓ
Ｉ ） ＴＳ 序列并 与 已经 公布 的毛 首线 虫序列 进行 比较 和
毛首线 虫 （ ｒ ｈ ｒ ）呈 世 界性 分 布 ， Ｔ ｉ ｕｉ ｃ ｓ 是一 类 寄 生 于多种动 物体 内的线 虫 ， 体前 部 呈 毛发 状 ， 称 虫 故 毛首线虫 ， 也称为鞭虫 ， 虫 多寄生 于宿 主的盲 肠 ， 成 可
以引 起 毛 首 线 虫 病 （ ｒ ｈ ｒ ｓ ）＿ 。毛 首 线 虫 属 的 Ｔ ｉ ｕｉ ｉ Ｌ３ ｃ ａ ｓ １＿
量相 同的无菌双 蒸水 。 Ｐ Ｒ扩增产 物 以 １ ／ Ｃ ０ｇ Ｌ的琼脂 糖凝胶 为载体 ， 在 ０５ Ｂ ． ×Ｔ Ｅ缓 冲液 中进行 电泳 ， 溴化 乙锭 （ Ｂ 染 Ｅ ） 色， 电泳结束 后将凝胶放 于紫外 透射 仪上 ， 通过凝 胶 成像 系统摄 像并记 录结果 。
１ ２ ３ 扩 增 片段 的 克 隆 和 筛 选 ．． 采 用 切 胶 回 收 的
用 纯化 回收 试剂 盒 回收 ２个 样 品 的 Ｐ Ｒ产 物 Ｃ 并将之克隆到 ｐ Ｅ Ｔ Ｅｓ Ｇ Ｍ— ａｙ载体 ， 后 转 化 至感 然 受 态细胞 并进行 菌液 Ｐ Ｒ鉴定 。将 菌液 Ｐ Ｒ扩增 Ｃ Ｃ 产 物于 １ ／ ０ｇ Ｌ琼脂糖凝胶 进行 电泳 ， 可见大 小约 为 １５ ０ｂ ， ０ ｐ 与预 期 目的片段大小 一致的条带 （ ２ 。 图 ）
分析 。
２ Ｌ ， 匀 后 ， 于 微 量 恒 温 器 中 ， ５ ℃ 反 应 １ Ｏ ）混 放 ５ ５ｈ
～
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
１ ， 隔 １ｈ～ ２ｈ震 荡 １ 。 消 化 完 全 后 ， 据 ８ｈ 每 次 根
Ｐｏ ｇ ｒ ｍｅ ａ试 剂 盒 的 Ｗ ｉａ ｄ ＤＮＡ ｅ ｎ Ｕｐ Ｓ ｓ ｚｒ Ｃｌａ — ｙ —
９ ． ％。 ９ ２ 将序 列与 Ｇｅ Ｂ ｎ 丁 公 布 的相 关序 列进行 比较 分析 ， 果显 示与羊毛 首线 虫的 Ｉ Ｓ 、 ． ｎ ａ ｋＭ 结 Ｔ １ ５ ８Ｓ和 Ｉ Ｓ Ｔ ２ 序 列相似性 高 ， 别为 ９ ． － ９ ． 、０ 和 ９ ． ６ ８ ０ ， 明斑 鼻羚 体 内分 离的毛 首 线 虫属 于羊 分 ７ ３／ ９ ６ ７６ ｉ０ ７ ８／～９ ． 表 ９
毛首 线 虫。
关 键 词 ： 鼻 羚 ； 首 线 虫 ； 转 录 间 隔 区 ； Ｃ 技 术 ； 列 分 析 斑 毛 内 Ｐ Ｒ 序
中 图分 类 号 ： ８ ２ ７ １ ￥ ５ ． ３ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ７５ ３ ２ １ ） ３０ ４ — ４ １ ０ — ０ ８（ ０ １ ０ — ０ ７０
１ １ １ 虫体 样 品 ２ ０ ． ． ０ ７年 １ 月 ２ 日采 自广 东 省 茂 １ 名 野 生 动 物 救 护 中 心 斑 鼻 羚 消 化 道 内 ， 过 初 步 形 经
ｔｍ 使 用 说 明 ， 取 样 品 虫 体 的 Ｄ ｅ 提 ＮＡ， 于 一 ２ ℃ 置 ０ 中保 存 。
收稿 日期 ： ０ ００ — ２ ２ １ — ８０ 基 金 项 目 ： 育 部 “ 江 学者 和 创 新 团 队发 展 计 划 ” 新 团 队 项 目（Ｒ ０ ２ ） 教 长 创 Ｉ Ｔ ７ ３
作者简介： 任 娣 （ ９７ １８ 一） 女 ， 东 烟 台人 ， 士 研 究 生 ， 要 从 事兽 医寄 生 虫学研 究 。 ＊通 讯 作 者 ， 山 硕 主
４ ８
动 物 医学 进 展
２１ 年 ０１
第 ３ ２卷
第 ３期 （ 第 ２ ３期 ） 总 １
１ ２ ２ Ｐ Ｒ 扩 增 目的 片段 由 上 海 英 骏 生 物 技 术 ．． Ｃ
Ｍ ．ＤＮＡ ａ ｋ ｒＤＬ ２ ０ ０；１ Ｍ Ｍ ３；２ Ｍ Ｍ ４，３ Ｎｅ ａ ｉ ｅ ｃ ｎ ｒ ｌ Ｍ ｒ ｅ ０ Ｉ ． ． ｇ ｔ ｏ ｔｏ ｖ
图 １ 斑 鼻 羚 毛 首线 虫 Ｉ ＴＳ序 列 的 Ｐ ＣＲ扩 增 结 果
ｇ １ Ａｍｐ ｉｉａ ｉｎ ｏ ＴＳ ｒ ． ｌｆ ｔ ｆＩ ＤＮＡ ｆＴ ｉｈｕ ｉ ａ ｌ ｓ ｆｏ ｃ ｏ ｏ ｒ ｃ ｒ ｓｓ ｍｐ ｅ ｒ ｍ
记 。Ｏ ｉ ｒ ］ ｌ ｅｓＲ等 Ｌ 对 羊 毛 首 线 虫 、 羊 毛 首 线 虫 、 ｖ ４ 绵
Ｘ ｇ ｌ 为宝 生物工 程 （ｖ 有 限公 司产 品 ； —ａ 均 ３ 连） 凝胶 成 像分 析仪 为英 国 ＵＶ ＴＥ Ｉ Ｃ公 司产 品 ； ｉｍｅｒ Ｐ Ｒ Ｂｏ ｔａ Ｃ 仪为 德 国 Ｂｏ ｔａ 司产 品 ； ｉ Ｒ ｉｍｅｒ 公 Ｂ ｏ ＡＤ 电泳 仪为 美 —
Ｍ． ＤＮＡ标 准 Ｄ ０ ；． Ｌ ２０ ０ １ＭＭ３ ２ ＭＭ４ ３ 阴性 对 照 ；． ；．
Ｍ． ＤＮＡ ａ ｋ ｒＤＬ ０ １ Ｍ Ｍ ３；２ Ｍ Ｍ ４｛３ Ｎｅ ａｉｅｃ ｎ ｒ ｌ Ｍ ｒ ｅ ２０ ０；． ． ． ｇ ｔ ｏ ｔｏ ｖ
Ｍ． ＮＡ 标 准 ＤＬ ２０ ０ １ ＭＭ３２ ＭＭ４ ３ 阴性 对 照 Ｄ ０ ；． ；． ；．
采 用 扩 增 体 系 为 ２ Ｌ 体 系 （ 菌 双 蒸 水 ５ 无
１ ． Ｌ， Ｏ× ｂ ｆｅ ． Ｌ， ｇ ２ ２ ６０ １ ｕ ｆｒ ２ ５ Ｍ Ｃ１ （ ５ ｍｍｏ／ ｌ Ｌ）
为 阳性 的重 组 菌送 深圳 华 大基 因公 司测 序 ， 然后 将 测序 结果用 Ｄ ｔｒ ＮＡ Ｓａ 软件进行序 列分析和 比较 。
（ ． 南农 业 大学 兽 医学 院 ， 东 广 州 ５ ０ ４ ； ． 州 动 物 园 ， 东 广 州 ，５ ０ ７ ； １华 广 １６ ２ ２ 广 广 １ ０ ０
３ 中 国农 业 科 学 院 兰 州 兽 医研 究 所 家 畜 疫 病 病 原生 物 学 国家 重 点 实 验 室 ， ． 甘肃 兰州 ７ ０ ４ ） ３ ０ ６
１ ２ １ 虫体 ＤＮＡ 提 取 从 一 ２ ℃ 的 ７ ０ ｍＬ／ ． ． Ｏ ０ Ｌ
属 的分类学 中是 比较理 想的分 子遗 传标记 ， 获得 了各
虫 种 的序 列 数 据 。 本 文 以从 广 东 地 区 珍 贵 动 物 斑 鼻 羚 体 内 收 集 到 的 毛首线虫为 研究对 象 ， 其进 行 分子 分类 学 研究 ， 对 获 得 内 转 录 间 隔 区 （ｎｅｎ ｌｔａ ｓｒ ｅ ｐ ｃｒ ， ｉｔｒ ａ ｒｎ ｃｉ ｄ ｓ ａ ｅｓ ｂ
态 学鉴定 为 毛 首 线 虫 ， 品代 码 为 ＭＭ３和 ＭＭ４ 样 。 在 ７ ０ｍＬ Ｌ的酒 精 中保 存备用 。 ０ ／
１ １ ２ 主 要 试 剂 和 仪 器 Ｄ ． ． ＮＡ 提 取 试 剂 盒 Ｗ ｉ ｚ — ａｄＭ ＤＮ Ｃ ｅｎ Ｕｐ Ｓ ｓｅ 为 Ｐ ｏ ｇ ｒＴ Ａ ｌ ｙ ｔｍ ａ ｒｍｅ ａ公 司 产
国 Ｂ ｏＲａ 公 司 产 品 ； 回 收 试 剂 盒 为 上 海 华 舜 生 ｉ— ｄ 胶 物工程公 司产 品。
１ ２ 方 法 ．
球鞘 毛首线虫 、 兔毛 首线虫 、 猪毛首 线虫 、 氏毛首线 斯
虫 和 鼠 毛首 线 虫 进 行 研 究 ， 现 Ｉ Ｓ序 列 在 毛 首 线 虫 发 Ｔ
３ ， ５ ℃ ３ Ｓ ７ ℃ ３ Ｓ ３ 个 循 环 ， ２ ℃ ０８ ５ ０ ， ２ ０ ，０ ７
泳， 可见 大小约 为 ｌ５ ０ｂ ， ０ ｐ 与预期 目的片段 大小一
致 （ １。 图 ） ２２ 克隆 、 化及 菌液 Ｐ ． 转 ＣＲ
５ｍｉ。 时设 置 阴性 对 照 组 ， ｎ同 只加 入 与 样 品 Ｄ ＮＡ 份
Leabharlann Baidu
３ ０ Ｌ 上 下 游 引 物 各 ０ ２ Ｌ，Ｔ ｑ酶 ０ ２ Ｌ， ． ， ．５ ｒａ ．５
ＤＮＡ 样 品 １ Ｌ） 。
２ 结果
２ １ Ｐ Ｒ扩增产 物的 电泳 ． Ｃ
将 Ｐ Ｒ 扩 增 产 物 于 １ ／ Ｃ ０ｇ Ｌ琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电
Ｐ Ｒ反 应 条 件 为 ９ ℃ 预 变 性 ５ ｒｉ， ４ ℃ Ｃ ４ ｎ９ ａ
方法对 Ｐ Ｒ产 物进行 纯化 ， 纯化后 的产 物连接 到 Ｃ 将 ｐ Ｍ－ ａｙ载体上 ， ＧＥ Ｔ Ｅ ｓ 通过 转化试 验将 连接 之后 的
Ｍ ｌ ２ ３
ｌ０ ００ｂ ７５ ０ｂ
１０ ００ｂ —＋ ｐ
７５ ｐ ０ｂ
５ ００ｂ
５ ｐ ． ００ ｂ —— ．
上 游 引 物 ＮＣ ： ， ＡＧＧ ＡＡＣ ＴＧ Ｇ ５ ５＿ ＧＴ ＴＧ Ｃ Ｃ —
ＧＡＡＧＧＡＴＣ ＡＴＴ ３ ； 下 游 － 引 物 ＮＣ２ ５一 ：
Ｔ ＴＡ Ｇ ＴＴＴ ＣＴ ＴＴＴ ＣＣＴＣＣＧ ＣＴ一 。 ３
１ ２ ４ 测序 与分析 ．．
挑选 ＭＭ３ ＭＭ４ 品 中鉴定 、 样
分类一直是令人 困扰 的问题 ， 至今 仍 没有统 一 的分 类
体 系 ， 种异 名 在 毛 首 线 虫 属 分 类 学 中 比 较 突 出 ， 同 主
品 ； 白酶 Ｋ 为 Ｍｅｅ ｋ公 司产 品 ；Ｔ ｑ酶 、 制性 蛋 ｒｃ ｒａ 限
内切 酶 Ｅｃ Ｒ 工、 ｏ ＤＮＡ ａ ｋ ｒＤＬ ２ ０ ０ Ｉ Ｍ ｒ ｅ ０ 、 ＰＴＧ 和
摘 要 ： 茂 名 野 生 动 物 园斑 鼻 羚 体 内分 离 出 的 毛 首 线 虫 为 研 究 对 象 ， 保 守 引 物 Ｐ Ｒ 扩 增 其 核 糖 体 以 用 Ｃ Ｄ ＮＡ （Ｄ ｒ ＮＡ） 内 转 录 间 隔 区 （Ｔ ） ５ ８Ｓ序 列 ， 进 行 克 隆 、 化 、 序 和 序 列 分 析 ， 样 品进 行 分 子 鉴 的 Ｉ Ｓ 和 ． 并 转 测 对 定 。 结 果 获 得 ２个 毛 首 线 虫 样 品 的 Ｉ Ｓ及 ５ ８ Ｓ ｒ Ｔ ． ＤＮＡ 序 列 ， 长 为 １３ ６ ｂ ， 品 间 序 列 相 似 性 为 总 １ ｐ 样
酒 精保存 液 中取 出 单个 虫 体 ， 于一 新 鲜 灭 菌 过 的 置
１ ５ｍＬ离 心 管 中 ， 蒸 馏 水 反 复 吹 打 冲 洗 ３次 后 ， ． 用 浸 泡 ２ ｎ 吸 干 表 面 水 分 。 加 入 ２ ５肚 的 Ｓ Ｓ ０ｍｉ， ７ Ｌ Ｄ Ｄ ＮＡ 裂 解 液 （ ｕ ｌ ｌｓｓ ｏｕｉｎ ０ Ｌ； ｎ ｃ ｉ ｙｉ ｅ ｓｌｔ ，２ ０ ｏ