组织工程肌腱研究进展概述

转化生长因子（TGF-β） 骨形态蛋白（BMP） 结缔组织生长因子（CTGF） 血小板源性生长因子（PDGF） 血管内皮生长因子（VEGF） 胰岛素样生长因子1（IGF-1） 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 富血小板血浆（ PRP ）
…
生长因子的应用
直接应用
半 衰 期 较 短
缓释技术
合有 适效 的的 缓结 释合 载方 体式
案例1: Shen W, et al. Biomaterials. 2014;35(28):8154-63.
案例2: Zheng Z, et al. Acta Biomater. 2017;51:317-329.
对照组： SCS：海绵状胶原/蚕丝支架 实验组: ACS: 取向排列的胶原/蚕丝支架
脱细胞处理方法：反复冻融+冰冻切片+核酸酶处理
The gap measures 8cm.
最大的优势：
具有最接近人体的网架结构、生物力学性能和部分活性因子，有利于细 胞的黏附、生长及发挥生理功能，具备人工合成材料无法比拟的优点。
组织工程肌腱之生长因子
细胞因子( cytokine， CK)
是一类由活化的免疫细胞和相关细胞产生的高活性、多功能小分子蛋白质。
组织工程肌腱之种子细胞
3. 骨髓间充质干细胞（ BMSCs ） 研究最为广泛
优势：
✓ 取材方便
✓ 扩增迅速
✓ 具有多向分化潜能
✓ 免疫原性低
✓ 遗传背景稳定
2006年国际细胞治疗协会明确提出间 充质干细胞鉴定的最低标准，即同时满足： 贴壁生长； 细胞表面表达CD105、CD73和
CD90(≥95%，流式仪检测)；不表达 CD45、CD34、 CD14或 CD11b、 CD79α或CD19、HLA-DR(≤2%，流 式仪检测)； 能分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软 骨细胞。.
细胞表型发生变化 增殖速度缓慢，且传代后增殖能力不断降低 供体限制
自体肌腱细胞
人胚肌腱细胞
➢ 与成体肌腱细胞具有同样的合成胶原能力，且这种 能力不为传代所影响；
➢ 体外培养传至P13，细胞增殖能力变得十分低下。
电穿孔法导入pts A58H质粒，经潮霉素B筛选获得阳性克隆后扩增
人胚肌腱细胞系
➢ 与人胚肌腱细胞生长性状无差异； ➢ 增殖能力强； ➢ 可连续传代至P75； ➢ 但传至 70 代后出现复制衰老现象。
组织工程肌腱之支架材料 3. 复合材料
“取长补短”
天然高分子材料 + 人工合成材料
=
复合材料
稳定射流电纺丝法： 壳聚糖+明胶+聚乳酸（PLA）
组织工程肌腱之支架材料 4. 生物衍生材料（Bio-derived material）
用人或动物来源的材料, 经过去细胞、部分或完全去有机质或无机质、 去抗原等处理, 形成生物衍生材料。
组织工程肌腱研究进展概述
宁良菊 助理研究员 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室
肌腱是连接骨骼肌与骨骼的致密结缔组织，是骨骼肌的重要组成部分之一 ， 呈银白色，有光泽，质地坚韧，肌腱本身不具有收缩力，其主要功能是将肌 肉的收缩力传递到骨组织。
可溶性的胶原蛋白分子 不可溶性的胶原蛋白分子 微纤维 胶原原纤维 胶原纤维 初级纤维束 二级纤维束 三级纤维束 肌腱
Joseph P. Vacanti 美国马萨诸塞州立大学医院
哈佛医学院
组织工程发展史
组织工程产品
美国FDA批准上市： ✓ 组织工程皮肤(Apligraft、Dermagraft、OrCel、Transcyte 、Integra) ✓ 组织工程软骨(Carticle)
中国CFDA批准上市： ✓ 组织工程皮肤(安体肤) ✓ 同种异体骨修复材料（拜欧金） ✓ 同种异体肌腱修复材料（拜欧腱） ✓ 生物工程角膜(艾欣瞳)…
ห้องสมุดไป่ตู้
自分泌
旁分泌
内分泌
Ⅰ型 细胞
激素
Ⅰ型 细胞
激素
Ⅰ型 细胞
效应
Ⅱ型 细胞
效应
Ⅰ型 细胞
血流
Ⅱ型 细胞
效应
生长因子的作用特点
多效性： 一种GF——多种靶细胞——多种生物学作用 重叠性： 不同GF——同一靶细胞——相同或相似效应 拮抗性： 一种GF ——抑制——另一种GF的某种生物学效应 协同性： 一种GF —— 增强——另一种GF的某种生物学效应 网络性: 不同GF之间具有相互协同或者相互制约的作用
组织工程肌腱
种子细胞
力学刺激
组织工程 肌腱
支架材料
生长因子
组织工程肌腱之种子细胞 1. 自体肌腱细胞
Human tenocytes morphology at different passage (A) P0; (B) P1; (C) P4; (D) P8
Human tenocytes growth curves
可进行的实验研究包括：
Flexcell® Tension Systems
孤雌胚胎干细胞（parthenogenetic stem cells，pSCs）
类间充质干细胞（parthenogenetic mesenchymal stem cells，pMSCs）
10%拉伸应变；16h/d；每个循环包括10s拉伸和10s松弛
SCS
ACS
存在的问题：
1. 降解速度无法调节 2. 碎解后物质残留 3. 机体排异 4. 难以加工塑形等
组织工程肌腱之支架材料
2. 人工合成材料
聚羟基乙酸（PGA） 聚乳酸（PLA）/左旋聚乳酸（PLLA） 聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）
优势： 1. 来源充足 2. 易加工 3. 降解速度可调
组织工程肌腱之支架材料
天然高分子材料
人工材料
复合材料
生物衍生材料
组织工程肌腱之支架材料 1. 天然高分子材料
蚕丝/蜘蛛丝
胶原
壳聚糖
优势： 1. 自身及其降解产物无毒 2.具有良好的生物相容性、 3.保留了组织正常的三维网架结构 4.不易引起免疫排斥反应 5.植入人体后无刺激性 6.可被人体吸收
香港中文大学
提示：对于肌肉骨骼组织再生而言，TDSCs可能是一种比BMSCs更好的细胞来源！
组织工程肌腱之种子细胞 5. 脂肪干细胞（ ADSCs ）
优势： ➢ 取材容易 ➢ 对机体损伤小 ➢ 来源广泛 ➢ 体内储备量大 ➢ 适宜自体移植 ➢ 没有伦理学争议
组织工程肌腱之种子细胞 6. 其他干细胞
肌腱损伤是一个常见的临床问题。
对于肌腱损伤/缺损的治疗，多年来一直是骨科医 生面临的重大挑战！
➢ 少供血 ➢ 低代谢
自我修复和再生 能力有限
目前临床上常用的治疗方法：
各有局限性，
自体
难以令人满意！
移植
天然
肌腱
同种
材料 增强
损伤
异体 移植
合成 材料 移植
组织工程 技术
Robert S. Langer 美国麻省理工学院
根据功能分类：
✓ 白细胞介素（ IL） ✓ 干扰素（ IFN） ✓ 肿瘤坏死因子（TNF） ✓ 集落刺激因子（CSF） ✓ 生长因子（GF） ✓ 趋化因子（chemokine）
一类具有刺激细 胞生长的细胞因
子。
通过质膜上特异的受体，将信息传递至细胞内部，调节细胞生长与增 殖的多肽类物质。
生长因子的作用方式
2.5cm长全厚缺损
术后12W
临床案例
修复喙锁韧带损伤（完全断裂）
组织工程肌腱
P3 人胚肌腱细胞 医用碳纤维(CF) +医用可吸收缝线 (PGA)
术后半年随访： 患者肩关节功能恢复正常
术后6个月取微量组织进行组织学观察
40×
100×
体外转染含hTERTcDNA全长的质粒pGRN145
重建端粒酶活性、延缓细胞衰老，可稳定传至95代
构建标准细胞系，筛选支架材料
组织工程肌腱之种子细胞
2. 皮肤成纤维细胞
相同点： ➢ 细胞形态相似，均呈梭形； ➢ 均可以合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白、糖
胺多糖和糖蛋白等 不同点： ➢ 细胞增殖能力不同； ➢ 合成胶原类型不同； ➢ 合成胶原纤维排列不同。
组织工程肌腱之支架材料
理想的支架材料应具备的条件：
可调节降解率的生物降解性能； 降解之前，降解中以及降解后的产物都应具有良好的生物相容性； 具有生物功能性：能够支持细胞的增殖和分化、细胞外基质的分泌和组织的 形成； 可加工性：能通过加工形成理想的复杂结构和形状的复合物，如纺布或针织的支架等。
组织工程肌腱之支架材料
猪小肠粘膜下层(SIS)
脱细胞真皮基质
脱细胞肌腱组织
源于人体肌腱，具有良好的生物相容性 和力学性能。
经多步程序处理，去除病毒、降低免疫 原性，安全性好。
成品为干燥状态，易于保存运输。 获得国内唯一CFDA注册证。
脱细胞肌腱片状材料
(Decellularized tendon slices, DTSs)
聚己内酯（PCL）
案例1: Rothrauff BB, et al. Tissue Eng Part A. 2017;23(9-10):378-389.
Maximum suture-retention strength of scaffolds
存在的问题：
1. 亲水性差 2. 细胞黏着力弱 3. 组织相容性不理想
转基因技术
病 毒 载 体 的 安 全 性
组织工程肌腱之力学刺激
静态力学刺激 动态力学刺激
组织工程肌腱之力学刺激
静态力学刺激
动态力学刺激
3%拉伸应变；12h/d；20min/h；12个循环/min
➢ 能产生周期性拉伸、压缩应变 ➢ 应变频率范围 0~4Hz ➢ 应变大小范围0~100%
应力场三维细胞培养系统
不同种属来源BMSCs的自发钙化观察（茜素红染色） 提示：有效调控BMSCs腱向分化是将其应用于组织工程肌腱的一个重要前提！
组织工程肌腱之种子细胞 4. 肌腱来源干细胞（ TDSCs/TSPCs） 最具前景
美国匹茨堡大学
TDSCs ＞BMSCs
✓ 克隆形成能力 ✓ 成腱/成骨/成脂/成软骨分化能力
人诱导性多能干细胞（human-induced pluripotent stem cells，hiPSCs） 孤雌胚胎干细胞（parthenogenetic stem cells，pSCs） 牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs） 经血源子宫内膜干细胞（menstrual blood stromal stem cells，MenSCs）
pSCs- derived tenocytes
异位成腱
裸鼠皮下模型
Vacanti Mouse 一只有“故事” 的裸鼠
常用的动物模型
原位修复
兔肩袖缺损模型
SD大鼠髌腱缺损模型
部分缺损
兔跟腱缺损模型
全缺损
猴指深屈肌腱缺损模型
四川猕猴
A1：生物衍生肌腱材料+PGA+肌腱细胞 A2：生物衍生肌腱材料+PGA B1：生物衍生肌腱材料+肌腱细胞 B2：生物衍生肌腱材料 C：自体肌腱移植组