2019年临床本科毕业论文范文

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题目：红芪多糖的纯化及初步结构鉴定

论文摘要：目的研究红芪多糖的分离纯化及初步的结构。方法

采用超声辅助提取多糖，比较Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正

丁醇法脱蛋白的效果，并用GC、TLC及IR分析多糖的初步结构。结

果三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白，经SephadexG-25柱层析分离纯化后得红芪多糖2(HPS-2)，HPLC确定为均一多糖，糖含量为98.2%，糖组

成分析表明其含有鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，摩尔比为.3∶.2∶2.7∶16.1∶2.。结论HPS-2是一种以β苷键为主的吡

喃型杂多糖。

论文关键词：红芪多糖;薄层色谱;结构鉴定

红芪(RadixHedysari)，为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz的干燥根，为甘肃特产名贵药材，在临床上主要用于补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌。红芪中含有氨基酸、有机酸、β-谷甾醇、红芪多糖、微量元素等众多的生物

活性物质[1]。近年来研究发现，红芪多糖的活性成分具有增强机体

免疫力、抗肿瘤、抗衰老、治疗糖尿病等作用[1，2]。特别是我们近几年的研究发现，经7%乙醇沉淀部分药理作用尤为明显。由于多糖

为大分子化合物，分离纯化比较困难，而蛋白质的脱除是后期结构鉴定的关键之一，为了提高多糖的得率、纯度及活性，本实验对这部分多糖进行了脱蛋白方法的研究，结合TLC、GC、IR等方法对HPS-2的结构进行了初步的分析，以期为红芪多糖的进一步研究提供理论基础。

1材料与仪器

红芪，购自甘肃武都;牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-25(西安周鼎国生物技术有限责任公司);单糖对照品(中国药品生物制品检定所);SephadexG-25(上海长征制药厂);硅胶G(青岛海洋化工厂);其它试剂均为分析纯。

CR22GⅡ型离心机(日本日立);UV-17型紫外仪(日本岛

津);GC-Clarus5型气相色谱仪(美国PerkinElmer公司);红外光谱仪(NicoletNEXUS67);BS-1A自动部分收集器、HL-2恒流泵(上海沪西分析仪器厂有限公司);美国Waters6型高效液相色谱仪，配Waters2414型示差折光检测器。

2方法

2.1红芪多糖的提取纯化路线其流程如下。

2.1.1提取红芪药材→粉碎→超声脱脂→热水提取3次→合并提取液→减压浓缩后离心→取上清液→乙醇沉淀→有机溶剂洗剂→

透析→减压浓缩→冷冻干燥得粗多糖HPS。

2.1.2纯化粗多糖液→脱蛋白、色素→SephadexG-25柱层析→洗脱液透析→浓缩→冷冻干燥→精制红芪多糖HPS-2。

2.2蛋白质和多糖含量的测定蛋白质含量测定采用考马氏亮蓝法[3]，多糖含量采用苯酚-硫酸法[4]。

2.3脱蛋白方法

称取一定量的粗多糖，加入适量蒸馏水，6℃加热溶解，备用。本实验采用3种脱蛋白的方法。

2.3.1Sevag法取粗多糖溶液，加入等体积的氯仿-正丁醇(V/V 为4∶1)试剂，混合振摇3min，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。

2.3.2三氯乙酸法取粗多糖溶液，加入多糖溶液体积.1倍量的三氯乙酸，低温(4℃)剧烈振摇3min，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。

2.3.3三氯乙酸-正丁醇法

取粗多糖溶液，加入等体积的三氯乙酸-正丁醇(V/V为1∶1)

试剂，振荡1min，静置分层，收集下层水溶液，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。

2.4红芪多糖的精制将一定量的脱蛋白多糖，溶解于适量蒸馏水中。过氧化氢除色素，减压浓缩，经醇沉、离心、冷冻干燥得红芪多糖1(HPS-1)，取适量的HPS-1，蒸馏水溶解后，SephadexG-25柱分离，蒸馏水洗脱，流速.8ml/min，每3ml收集1份，苯酚-硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线，合并主峰流出液，减压浓缩至一定体积，冷冻干燥得HPS-2。

2.5纯度鉴定用HPLC法，TSK-gelG25PW色谱柱，示差折光检测器，流动相为双蒸水，流速1.ml/min，检测器温度35℃，样品浓度4mg/ml，进样量5μl。同时取该样品溶液在2～4nm范围内进行紫外扫描。

2.6气相色谱参照文献[5]，多糖样品经彻底水解后制备糖腈乙酸酯衍生物，以单糖的糖腈乙酸酯衍生物为对照品进行GC分析。色

谱条件:OV-11毛细管柱(5m×.32mm)，载气为N2，流速5ml/min，分流比4∶1，FID氢火焰检测器，汽化室温度25℃，检测器温度28℃。程序升温:11℃(保持5min)→(5℃/min)→28℃(保持2min)。进样量.4μl。

2.7薄层色谱[6]取15mgHPS-2，三氟醋酸彻底水解，水解产物溶于1ml蒸馏水中，以标准单糖为对照，分别取样品水解液和单糖对照液在含磷酸二氢钠的硅胶G薄层板上点样，上行二次展开，展开剂:醋酸乙酯∶冰醋酸∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2(V/V);自然风干后显色，显色剂:苯胺-邻苯二甲酸溶液，烘箱中15℃加热5～1min显色。

2.8红外光谱测定取2mgHPS-3，KBr压片，测定红外光谱。

3结果

3.1脱蛋白方法的选择以蛋白脱除率和多糖损失率为指标，比较Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法的脱蛋白效果(见图1)。Sevag法的多糖损失率最低，但脱蛋白率也最低;三氯乙酸-正丁醇法的脱蛋白率最高，多糖损失率最低;三氯乙酸法的脱蛋白率达3%以上，但多糖损失最高。综合各方面的因素，本实验选取三氯乙酸-正丁醇法脱除红芪多糖中的蛋白质。

3.2红芪多糖分离纯化红芪多糖经SephadexG-25柱层析纯化分离的洗脱曲线(见图2)。仅出现1个洗脱峰，收集主峰，透析，浓缩，冷冻干燥，得到HPS-2。

3.3纯度鉴定HPS-2的紫外扫描在26～28nm处吸收峰消失，茚三酮反应呈阴性，说明样品中的蛋白质基本除尽，也无核酸存在;碘-