关于PCR总结.

PCR总结

若模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。

酵母、细菌及质粒基因组，每次反应的模板最大加入量分别为10ng，1ng和1pg。

引物的设计原则

1．引物的长度应适宜，一般要求18~25bp，一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。

2．基本成分：G+C的含量一般为40%~60%。四种碱基应随机的分布，避免碱基堆积的现象。尤其引物的3’端，不应有连续的3个G或C，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。

3．引物自身：引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp 的自身互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构，将影响引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。

4．引物之间：引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。由于PCR反应体系中含有高浓度的引物，即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会使引物相互杂交，最终得到引物二聚体的扩增产物。若引物二聚体在PCR反应的早期形成，它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。通过精心设计引物、应用热启动PCR(hot start PCR)或者降落PCR(touch down PCR)及特制的DNA聚合酶，可以减少引物二聚体的生成。

5．3’末端：引物的3’端（羟基端）是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。

6．溶解温度：3’端引物和5’端引物应有相似的T m值（不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。），其差别不应大于5℃。扩增产物与引物的T m值的差别应小于10℃，以确保PCR循环中的扩增产物有

效的变性。

8. 引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源。

9．引物的简并性：引物的3’端应为保守的氨基酸序列，即采用简并密码较少的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于引物的3’端。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。

引物的用量

在PCR反应体系中，引物的浓度一般要求在0.1~0.5µM之间，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。引物浓度过低，则产物量低；引物浓度过高则会促进引物二聚体的形成以及非特异性产物的形成。

反应缓冲系统

反应缓冲系统提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。目前最常用的缓冲液是10~50mmol/L的Tris-HCl

(pH8.3~8.8，20℃)，在72℃时，其pH值为7.2左右。反应缓冲系统中还含有KCl，50mM以内的KCl有利于引物的退火，而50mM以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。然而，也有人认为含有50mM KCl的缓冲系统有利于大于500bp的DNA片段的扩增，然而将缓冲系统中的KCl浓度提高到70~100mM则有利于提高较小的DNA片段的扩增产量。

Mg2+

反应体系中Mg2+浓度低时，酶的活力显著降低；过高时，酶则催化非特异性扩增。此外，Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。值得注意的是，由于PCR反应体系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低Mg2+的实际浓度，因此一般Mg2+的加入量应比dNTP的总浓度高0.2~2.5mmol/L。dNTPs

许多厂商出售专门用于PCR的d NTP ( deoxy-

具有较强的酸性而不含焦磷酸盐，其目的是保护dNTP在储存液的冷冻和加热期间受到破坏。因此在使用前应用NaOH将pH值调至7.0~7.5。无论是自配的还是购买的dNTPs溶液在储存前都应分成较小的几份，然后在-20℃下储存，经过两次冷冻-加热循环后储存液就必须丢弃。若长期在-20℃下冻存，储存液中的少量的水分会蒸发而后凝结在储存容器上，因此储存dNTP液的容器在加热后应在微型离心机中离心数十秒以减少dNTP浓度的变化。PCR的反应条件的选择

退火温度确定后，退火的时间并不是关键性的因素，但也应加以控制。退火时间过短，会导致延伸失败；而退火时间太长会增加引物与模板间的非特异性结合。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR 退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。表5列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。

表5. 估算Tm的公式

如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析

通常的PCR反应体系中，dNTP的浓度应在

20~200µmol/L之间，在此范围内，PCR的产量、特异性和忠实性之间的平衡最佳。

由于Taq pol没有校正阅读功能，在扩增过程中可引起碱基错配，通常可应用低浓度的dNTP(各

20µmol/L)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq pol的忠实性。此时的平均错配率仅为5×10-6次/核苷酸循环(通常30次循环的Taq pol的错配率约为0.25%)。在其它参数最佳的时候，每100µl反应液中加入1~2.5U的Taq pol为最佳。通常在100µl的反应体积中加入0.5~5U酶的范围内试验酶的最佳浓度。

循环参数