植物病毒病害抗性鉴定

实验15 植物病毒病害抗性鉴定

植物病毒是导致粮、菜、果、花卉产量下降、品质变劣的重要原因之一。自1892年俄国Iwanowsky发现烟草花叶病毒以来，己被正式命名的植物的病毒789种，并明确病毒只含有一种类型的核酸，即核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）， 70年代后发现了只含有小分子量 RNA、不含蛋白质、侵染活性很高的类病毒25种，80年代后发现了含有线状病毒基因组RNA和与类病毒相似的环状RNA的拟病毒40种。

植物病毒种类多，繁殖速率快，传播途径广，并且缺少有效防治药剂和措施。因此，植物病毒病一旦流行，危害之重，己超过真菌、细菌病害。因此，加强植物病毒研究，减轻植物病毒危害，对国民经济的发展具有重要意义。

本实验重点学习目前普遍采用的几种植物病毒病害检测及抗性鉴定的方法及步骤。

一、试材及用具

1．试材发病的植物组织及家兔等。

2．仪器及试剂高速冰冻离心机，离心管以及分子量为6000的聚乙二醇（PEG6000）、氯仿等。

二、方法步骤

（一）病毒检测

可用于植物病毒检测的方法主要有生物学测定、血清学检测、电镜检测、免疫电镜以及酶联免疫吸附反应（ELISA）、免疫PCR等分子生物学方法，其中血清学检测是快速、准确、

图5－1 病毒抗原的分离与纯化

灵敏度高、成本低的病毒检测方法，可用于实际检验检测工作中去。本实验重点介绍，其它方法可查阅有关文献资料。

利用血清学技术进行病毒检测，主要依据血清学反应（免疫学反应），即抗原与抗体之间发生的各种作用。抗原指的是能诱导产生抗体的一类物质，它可以是病毒、细菌、真菌、植物菌原体等微生物，也可以是酶类、DNA、RNA、类脂、多糖等有机化合物，甚至还可以是叶片、枝条等各类组织。抗体是指由抗原注射到动物体内诱导产生的、并能与抗原在体外进行特异性反应的一类物质，庄要是一些免疫球蛋白。含有抗体的血清通常称为抗血清。抗原能与由其诱导产生的抗体发生凝集、沉淀等反应，利用病原物中特异性强的抗原与相应的抗体反应，就能实现对病原物（病毒）的检测、鉴定。目前国际上己制备出 200余种重要植物病毒抗血清。我国农业部植检所为满足植物病毒检疫的研究和需要，先后制备出 30余种植物病毒抗血清。因此，利用血清学技术检测病毒，主要包括如下三个环节：1．病毒抗原的分离与纯化利用高速冰冻离心机等设备以及聚乙二醇（PEG）、氯仿等化学药品，从冰冻的病组织中分离、纯化病毒抗原。其操作步骤如图5－1所示。

2．病毒抗血清的制备病毒抗血清的制备主要包括试验动物选择、抗原注射、血样采集以及抗血清的收集与保存等过程，可用图5－2表示：

图5－2 病毒抗血清的制备与保存

3．血清学反应将抗血清及抗原进行一系列稀释后，采用试管沉淀、小试管环状沉淀、玻片凝集、免疫双扩散、免疫电泳及荧光抗体等反应方法进行血清学反应，从而实现对病毒的检测与鉴定。

（二）病毒病抗性鉴定

病毒检测的对象是病原物（病毒），是对病毒定性（病毒的有无及其种类）与定量的分析鉴定，而抗性鉴定的对象是寄主，即植物品种或种质对特定病毒的抵抗能力。目前植物病毒病抗性鉴定所采用的方法，大都为大田病圃法。例如，刘琴等（2002）对110个小麦引进品种在自然病圃区进行了对小麦黄花叶病的抗性鉴定。主要做法是，每个品种分别播种，设置对照与重复，于病害发生期调查发病率。所采用的病情分级标准是：

1级 抗（R）：发病率0%～9.9%；

2级 中抗（mR）： 发病率 10%～19. 9%；

3级 中感（MS）：发病率 20%～39.9%；

4级 感（S）：发病率＞40%。

三、作业思考题

1．植物病毒检测有哪几种方法？各有何优缺点？

2．何为抗原？抗体？抗血清？

3．血清学技术检测植物病毒，主要包括哪几个步骤？

（陈学森）