植物细胞工程的笔记 原版

绪论
1生物技术：以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官，组织，细胞的特性和功能，设计和构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合体系。

内涵：运用生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质。

2细胞工程：是以细胞学，遗传学，发育学及分子生物学等理论为基础，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究和改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞，细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的科学。

3植物细胞工程：以植物组织和细胞为基本单位，在离体条件下进行培养，繁殖，或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，以获得有用无知的过程。

4细胞全能性：高等植物的组织和器官可以不断分割，直到单个细胞，如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能力，那么可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个体。

（一个生活细胞所具有完整生物个体的潜在能力）
5植物细胞的工程类别
培养层次：植株培养。

器官培养，胚胎培养，愈伤组织，细胞培养，原生质体培养（原生质体：植物细胞脱除细胞壁后的完整细胞培养。

）6应用：在植物育种上(1快速获得特殊倍性材料，2克服远缘杂交不亲和，3克服杂交种胚早期夭折，4导入外源基因，5突变体筛选，6种质资源保存），种苗脱毒和快速繁殖，细胞培养生产有用的次生代谢产物，在细胞学说和发育生物学研究中，在植物遗传，生理生化以及病理等基础研究中的应用
7 植物组织培养动物组织培养
细胞全能性细胞增殖
固体培养基液体培养基
蔗糖，植物激素葡萄糖，动物血清
植物体细胞株，细胞系
快速繁殖，培育无毒植株获得细胞或细胞产物
第一章
1生活细胞的全能性必须首先回复到分生状态或胚性细胞状态，（条件：离体，适当的刺激）
2植物细胞分类：第一类，茎尖，根尖，及形成层细胞，这类细胞始终保存分裂能力，从一个周期到另一个周期，称为周期细胞，第二类，筛
管，导管和气孔保卫细胞等特化细胞，为永久失去分裂能力的细胞，为终端分化细胞，第三类，表皮细胞及各种薄壁细胞，在通常情况下不分裂，但受到外界刺激后从新启动分裂，为G0细胞。

高度分化的细胞表现细胞全能性的能力降低或丧失，
2细胞的脱分化：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。

（静止细胞启动分裂都是分化细胞成功脱分化的重要标志，静止细胞：停止分裂，执行特定的代谢功能）
3脱分化过程的生理活动与细胞结构的变化：细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加，液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要标志。

变化最明显的叶绿体
4脱分化的过程：（1）启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现，（2）演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原生质体，（3）
脱分化终结期，细胞回复到分生细胞的阶段，细胞分裂即将开始。

5植物激素是离体培养中所必须的条件，因此与激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。

6细胞分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育过程，（一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能，这是在时间上的分化，同一种细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态和机能，是空间上的分化）本质是基因表达和调控的结果
7再分化，在离体的条件下，当细胞脱分化以后无序生长的细胞及愈伤组织要重新进入有序生长才能成为新个体。

基因选择性表达与修饰的人工调控过程。

8极性：植物的器官，组织甚至单个细胞在不同轴向上存在的某种形态结构及生理生化上的梯度差异，无论低等植物或高等植物都存在。

细胞的不均等分裂时细胞极性建立的标志。

极性建立与质膜离子通道的不对称分布和细胞周质微管的重排有关。

9管状分子（TE）由愈伤组织薄壁细胞分化形成，是愈伤组织细胞分化器官的前提，离体培养中TE的出现时组织分化的标志，分为三个阶段，叶肉细胞的脱分化，脱分化叶肉细胞向TE细胞转换，TE细胞特化阶段
10激素对细胞生长与分化的调控是一个复杂的级联调控过程。

11在离体培养条件下，植物细胞经过再分化形成完整的个体通过两天途径：器官发生和体细胞胚发生
第二节
1器官发生：在培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织)分化形成不定根
或不定芽等器官的过程。

离体培养下器官发生的难易，往往取决于研究对象的培养技术成熟程度及其调控机制基础研究的深度。

2离体培养中器官发生的方式:1先形成芽，后在芽上形成根，2先形成根，后在根上形成芽，3在愈伤组织的不同部位形成芽和根再通过维管束组织的联系形成完整的植株
4经过愈伤组织再分化器官的过程：1外植体经过诱导形成愈伤组织，2形成生长中心，也即愈伤组织形成器官的部位，3器官原基及器官形成不经过愈伤组织的器官发生：1外植体已经存在器官原基，2外植体某些部位的细胞重新分裂后形成分生细胞团，再由分生细胞团形成器官原基5起始材料对器官分化的影响：母体植物的遗传物质（器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异），外植体类型及生理状态（外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，有时甚至影响分化程度和器官类型。

6离体培养下器官分化，在大多数情况下时通过外源提供适宜的植物激素实现的，生长素与与细胞分裂素占主导地位。

7光照时间，强度及光质对器官分化均有影响
第3节：
1 合子胚体细胞胚
萌芽率高，质量好萌芽率低，质量差
受精卵体细胞
胚柄，明显即使有也不明显
形态固定，体积较小形态复杂，体积较大
变异率低变异率高
2体细胞的界定：其一：体细胞胚是离体培养的产物，只限与离体培养范围内使用，以区别无融合生殖胚，其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别合子胚，其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径
3体细胞的形成
外植体直接发生，经过愈伤组织的体细胞胚发生，细胞悬浮液培养的体细胞胚胎发生，
4与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植株的特点:体细胞具有双极性，体细胞胚形成后与母体的维管束系统联系较少，即出现生殖隔离现象
5影响体细胞胚发生的因素：（1）外缘激素（生长素对体细胞胚发生有重要的调控，细胞分裂素对维持在促进细胞分裂和维持细胞活跃生长中有重要作用）（2）
培养基：（3）不同基因型间体细胞胚形成能力的差异，（4）外植体类
型，采用幼胚，成熟胚，上胚轴和子叶为外植体，较容易产生胚性愈伤组织，而采用叶片，茎段等能形成体细胞胚
6体细胞胚胎发生的生化与分子基础：内源激素的变化，特异蛋白质，基因表达调控
第二章
1体细胞无性系:任何形式的细胞培养所产生的植株，而这些植株所表现的变异称为体细胞无性系
2离体培养下的稳定性，离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性，即使发生变异也可淘汰变异，也可以通过离体培养选择保留并稳定下来
3离体培养下的遗传变异的特点
普遍性，局限性，嵌合性
4影响体细胞遗传与变异的因素
供体植物(二倍体比单倍体的稳定)，培养基和培养方式，继代培养的次数（时间越久次数越多，则变异频率越高，
5体细胞变异的细胞遗传学基础：DNA核内重复负责，染色体断裂与重组，非正常的有丝分裂
6体细胞变异的分子遗传学基础：碱基突变，DNA序列的选择性扩增与丢失，转座子的活化，DNA甲基化
7离体培养诱导筛选体细胞无性系变异的优点，（1）由于筛选可以在离体培养下，从而可以在晓空间内对大量个体进行选择，（2）细胞突变体的筛选可以在几个细胞周期内部完成，且不受季节限制，因此筛选效率高，（3）诱变和筛选的条件可控制，从而提高重复性，（4）由于变异是在单细胞水平上进行的，因此一个突变体就是来自一个细胞，不会有非突变体细胞的干扰，避免整体植株水平上无性变异常呈现嵌合体，因而可以省去变异分离的麻烦，（5）理化诱变剂可较均匀地接触细胞，有较高的频率发生突变，增加选择的机会
8（1）体细胞变异诱导材料的选择：注意的问题，目标性状的可行性，必须充分考虑实验植物的细胞培养的技术水平，适当的细胞类型
（2）培养细胞的自发变异（3）培养细胞的诱变（物理诱变，化学诱变，复合因子诱变，转座子插入诱变，）（4）体细胞突变体的筛选（直接筛选法和间接筛选法）
9体细胞无性系变异的利用：创造育种中间材料或直接筛选新品种，基因克隆及功能鉴定，发育生物学研究，生化代谢途径研究
第3章植物细胞工程技术原理
1实验室：3个基本需要（实验准备，无菌操作和控制培养）
2洗涤：铬酸洗涤液是强氧化剂，去污能力很强，特别是在加热后去污效果更好，一般可在，40到45摄氏度使用，但铬酸洗涤液同时具有较强的腐蚀性，使用时要小心谨慎，以免发生意外，仅用于玻璃实验器皿，可反复使用，直至溶液呈青褐色为止。

洗涤方法，1玻璃器皿：新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质，其洗涤方法是用1%HCl溶液浸泡一昼夜，再用合成洗涤剂洗刷，然后用清水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗1到两次，干燥后即可使用。

已经使用过的试管，烧杯，三角瓶，将器皿中的残留除去，用清水洗净，再用合成洗涤剂洗刷，用清水洗干净后，最后用蒸馏水冲洗1到2次，，内径狭小的玻璃制品，先放入铬酸洗涤液中浸泡2h以上，经流水冲洗半个小时，再用蒸馏水冲洗1到二次，然后烘干，或晾干，载玻片或盖玻片，先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸泡几个小时，或者是用铬酸洗涤液煮沸半个小时，取出后用清水冲洗干净，将其贮藏在95%的酒精中，
2塑料品洗涤：用合成洗涤剂，冲洗必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗3金属用品，用酒精擦拭，不要洗涤剂，并保持干燥
3灭菌技术：灭菌是指杀灭培养物，培养基，培养用具及培养环境的杂菌，是防止微生物污染的最重要最基本的环节，物理方法，利用高温，射线等杀死微生物或通过过滤，离心沉淀等去除微生物，化学方法，使用消毒剂抗生素杀灭微生物
(1) 高压蒸汽灭菌：蒸馏水，各种器械，棉塞，1灭菌锅可装满，2锅内的冷空气排尽，3严格遵守保持压力的时间，20min 121摄氏度
(2) 过滤灭菌：用于易于分解而失效的某些化合物质，液体培养基和化学试剂
(3) 湿热和干热灭菌，湿热，玻璃，培养基，干热，玻璃器皿，金属，160摄氏度到180摄氏度，恒温40min，或120摄氏度灭菌2小时（4）熏蒸，熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，乙二醇，主要用于接种室和培养室灭菌，（5）药剂灭菌：70%到75%酒精，0.1%到0.2%氧化汞，10%的次氯酸钠，主要用于培养材料的表面灭菌，（外植体）
培养材料的灭菌原则，（重要）既要达到灭菌的目的，又不伤害组织和细胞
（6）灼烧灭菌，外焰，接种器械，瓶口，棉塞，包扎纸，瓶盖（7）紫外线照射，接种室空气和台面，花粉，15到20min
4培养基：植物细胞，组织器官吸取各种营养产所的地方，包括水分和各种营养物质。

培养基的配方是决定培养物能否正常生长或者能否达到培养目的的首要前提。

成分：无机盐，有机化合物，生长调节剂（基本培养基部含有生长调节剂）
（1）无机盐，大量元素（C，H,O，N，P，K，Na，Ca，Mg，S）每升几十至几千毫克，
微量元素（铁，通，锌，硼，锰，钴）10的-5次到-7次
（2）有机化合物：基本培养基质只含有无机盐类
作为碳源利用蔗糖，葡萄糖，果糖，，做为氮源利用氨基酸类和酰胺类糖类：既可以做碳源，又可以维持培养基的渗透压，
微生物：直接参与生物催化剂（酶），还参与植物蛋白质，脂肪的代谢等重要的生命活动
肌醇，腺嘌呤，氨基酸，其他复合成分，
（3）生长调节物质：生长素，促进细胞分裂和生长，有利于外植体的脱分化并启动细胞分裂，有利于形成愈伤组织，吲哚乙酸（IAA），萘乙酸（NAA），二氯苯氧乙酸（2,4—D），吲哚乙酸（IBA），
细胞分裂素：促进细胞分裂，调节器官分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成，
赤霉素（GA）
（4）水（5）其他附加成分，琼脂和活性炭
培养基种类：富盐培养基，高硝态氮培养基，中盐培养基，低盐培养基，
如果将某一物质的量浓度高的溶液稀释到低浓度时，m1*V1=m2*V2
5外植体取材及培养条件的控制，
外植体：指用于离体培养的活的植物组织，器官等材料，它是植物离体培养的基础材料。

来源：1生长在自然环境下的植物，2有目的地培养在温室控制环境条件下生长的植物，2无菌条件下已经离体培养的植物
原则1尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物材料作为外植体来源，以减少培养过程中微生物感染，2必须取自自然生长的植物，可以尽可能避免使用那些生长过于潮湿和不洁环境中的植物，3对于在培养过程中可能出现内生菌污染材料，应尽量取生长旺盛的生长点部位作为起始培养的外植体。

取材大小，0.5到1cm,过大则污染，胚胎培养或脱青，0.5cm以下，过小，不易活
供体植物的管理：避免昆虫为害，注意防病，控制湿度
外植体灭菌：次氯酸盐一般用于一些教幼嫩的组织消毒，消毒时间5到30min，
氯化汞灭菌效果，一般用于种子，块根，块茎，及较硬的组织灭
菌，但是残留液最难去除，消毒剂和处理时间及方法会影响到灭菌效果和外植体的活力。

种子灭菌，芽，叶片，和茎等组织材料灭菌，未成熟胚，子房，及花药灭菌，70%的酒精清洗，吐温是润湿剂
接种条件的控制：1光照（强度，时间，光质），2温度20到30，（适宜的温度科提高细胞分裂速率，适当提高温度，有利于细胞伸长，在一定范围内降低，则会，是分裂和生长速度减慢，代谢减慢，有机物积累，细胞质量增大），3湿度，（培养容器，100%, 环境70到80%）4培养基的PH，5.5到6.5，引起培养基PH变化的原因，高温灭菌，培养物本身代谢产物释放，5渗透压 6气体调节，增加可利用的氧，除去有害气体，培养皿的封闭性主要与封口方式和材料有关，振荡培养时常用的改善通气条件的培养方式
第4章：植物组织和器官培养
1植物脱毒和快速繁殖的意义：能够有效保持优良品种特性；生产无病毒种苗，防止品种退化；快速繁殖新品种，加速优良品种推广，节约耕地，提高农产品商品产出率；便于运输。

2病毒在植物体内分布不均的机理：能量竞争，传导抑制，激素抑制，酶缺乏，抑制因子，
3植物脱毒的技术规程：（1）被脱毒植物携带病毒的诊断，指示植物，血清学，分子生物学，
（2）母体材料的选择和预处理，欲求脱毒材料的品种典型性，对外植体的健康程度进行选择，（3）茎尖分生组织培养再生植株，外植体消毒，茎尖剥离，茎尖培养。

(4)脱毒检测，指示植物鉴定，血清鉴定，分子生物学鉴定，（5）脱毒苗的保存与繁殖，脱毒苗的离体保存与繁殖，建立脱毒种苗生产繁殖网络体系，木本植物建立隔离的脱毒苗母本园
4影响脱毒效果的因素，母体材料病毒侵染的程度，起始培养材料的茎尖大小（茎尖越小，脱毒率越高），外植体的生理状态（顶芽脱毒效果比侧芽好，生长旺盛季节的芽为外植体脱毒比休眠芽或快速进入休眠芽的效果好
5离体繁殖：
外植体选择考虑的三个的问题：植物在自然条件下的繁殖特点，离体条件下茎芽的增殖方式，外植体的取材部分，大小和生理状态
培养物的增殖：（1）芽增殖，特点，主要表现在培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖，不需要添加外缘激素，如果某些植物需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。

（2）不定芽增殖，从现存的芽以外的任何器官和组织上通过器官重新形成的芽称为不定芽
特点，繁殖系数高，有较好的遗传稳定性
（3）体细胞胚增殖：特点：增长率高，胚的双极性免去了生根环节，但在同一培养体系中的体细胞休眠的诱导和解除难以控制而影响大规模繁殖的规范性，因此这个需要建立一个相对一致的体胚发育体系
（4）愈伤组织增殖，特点，成功率高，繁殖系数大，但是遗传稳定性较差，
生根培养：降低矿物营养的浓度，提高生长素浓度，具体应依据植物种类而定
生产用苗的培植
6离体繁殖的使用范围：某些难以繁殖或繁殖系数低的植物，或某些需要加速繁殖的特殊基因型; 自然无性繁殖极易感染病毒的植物；有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无性繁殖的。

7离体繁殖的遗传变异与控制，外源生长调节剂对品种典型性的影响，继代次数和变异，增殖方式的合理选择
8花药是器官培养，花粉是细胞培养
9单倍体，具有配子体染色体数的孢子体。

单倍体植物的明显特点：体细胞染色体数减半，生长发育弱，体形小，各种器官明显减小，雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代
10花药培养：
外植体的选择，供试材料的遗传背景（最多的茄科植物），材料的生育状态（幼年植株比老龄植株花药诱导率高），花粉的发育时期（单核中晚期到双核早期）
材料的表面消毒：未开放的花蕾取花药用70%乙醇擦拭表面，饱和漂白粉，0.1%HgCl无菌水冲洗，)\
接种：平板培养基，MS应用最普遍，
培养：光照（先弱后强），温度，
植物再生，
生根和移栽
11花粉的培养
花粉和小孢子培养取材适宜期大多数为花粉发育处于四分体到单核早期花粉的分离：机械分离法，花粉漂浮培养自然释放法，磁力搅拌法
花粉培养法：直接培养，预培养，哺育培养，看护培养，温室培养，双层培养
影响花粉和花药培养的因素：供体植物的基因型，生理状态（大田比温室的更适宜），花粉发育时期
预处理：启动分裂，冷处理，热处理，化学处理，其他方法
低温预处理的作用：1预处理引起花药，花粉内激素变化，改变了小孢子（花粉粒），第一次有丝分裂的轴向（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒）进而形成愈伤组织
2提供小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高诱导率
3引起小孢子孤立化，即小孢子从花粉中分离，因为低温处理过程中，花药，内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系4刺激花粉产生原胚
5促使细胞同步分裂
培养基的成分，无机盐，碳源，激素，有机附加物，
活性炭：作用，吸附琼脂中不利于花粉细胞生长的某些杂质，同时也可以吸附各种植物激素，从而调节内源和外源生长物质的水平
花药壁因子，可能具有促进作用
温度和光照
12花药和花粉培养中单倍体植株形成途径
单倍体细胞发育的方式：（1）单核小孢子起始培养的可能发育方式，一部分很快脱分化进行均等分裂进而形成小细胞团进入孢子体发育形成植株，另一部分继续体内的发育方式，在细胞内形成大液泡，进入晚期单核小孢子。

（2）二细胞花粉起始培养的可能发育方式，小的生殖细胞停止发育，大的营养细胞进入发育，然而形成孢子体；营养细胞停止分裂，生殖细胞进入孢子体发育；营养细胞和生殖细胞可能融合，由融合细胞继续分裂形成再生植株，称为二倍体花粉植株
植株的再生途径：通过胚胎发育途径形成单倍体植株。

通过愈伤组织形成单倍体植株
13花粉植株的倍性及染色体加倍
花粉植株的倍性：单倍体，二倍体，多倍体，非整倍体
染色体加倍：自然加倍，人工加倍（秋水仙素：组织细胞有丝分裂时纺锤丝的形成层）。

愈伤组织加倍法（愈伤组织经过继代培养后得到二倍体）
14胚培养的意义和类型：意义：1克服杂交育种中杂种胚的早期夭折2克服珠心胚干扰，提高育种效率3理论领域的应用
类型：成熟胚培养，幼胚培养
幼胚培养：1取材：多为球形胚和鱼雷形胚2幼胚剥离，容易失水，注意保湿，且操作迅速，尽量带柄 3接种培养，
幼胚生长方式：胚性发育，早熟萌发，愈伤组织
培养条件：培养基：蔗糖3%—10%，而心形胚和鱼雷胚只要去4%—6%。

（异性期和自养期），光照和温度。

15子房培养：包括授粉前和授粉后的
培养基：基本培养基，植物激素的影响，蔗糖浓度
单倍体来源和发育途径：助细胞或胚囊的无配子生殖产生单倍体；卵细胞，助细胞，反足细胞发育产生单倍体；非正常发育的大孢子四分体产生单倍体
16被子植物胚乳培养
发育特性：核型胚乳（经过游离阶段），细胞型胚乳（没有经过游离阶段），沼生目型胚乳
倍性特点：嵌合体的普遍性，倍性不稳定，倍性多倍化
第5章植物细胞培养及次生代谢产物生产
1植物细胞培养是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术。

培养规模（小规模培养和大批量培养），培养方式（悬浮培养，平板培养，看护培养），要求产物的不同（诱变细胞培养，生产次生产物的细胞培养）
2悬浮培养；单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。

多采用叶肉细胞和根尖细胞作为细胞来源，细胞分离方法是机械分离和酶分离
愈伤组织诱导：适宜的植物外植体材料：幼胚，胚轴，子叶
适宜的培养基，较高浓度激素浓度，必要的附加成分
愈伤组织的要求：松散性好，增殖快，再生能力强
悬浮系的建立与继代培养：
悬浮培养体系的三个条件：1悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30个到50个一下，2均一性，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或黄色，3细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般为2到3天甚至更短的时间便可增加一倍
悬浮培养细胞的同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期
分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选然后将同一状态的细胞继代培养与同一培养体系中，，优点，操作简单，分选的细胞处于自然生长状态，常规方法是梯度离心法
饥饿法，在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分散失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期，当细胞处于氮饥饿其，通常获得G1期的同步化细胞，当细胞处于磷和碳饥饿时，则可以获得G1和G2期的同步化细胞
抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合。