微生物研究进展chapter5分子生态学方法在环境微生物研究领域的应用.pptx
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主要研究微生物区系组成、结构、功能、适应 性发展及其分子机制等微生物生态学基础理论问题。
墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所 属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先 估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。
二、微生物分子生态学的研究方法
两种或两种以上四碱 基限制性内切酶酶切
与载体连接，转 入感受态细胞
与数据库 序列比对
系统发 育分析
微生物群落 结构信息
内切酶图谱分型
序列比对及分析
每种类型挑选1-3个 克隆测序
•优点 得到的序列信息比较完整 片段携带的信息量大，结果可靠 适合对环境中微生物群落的整体结构进行分析
•缺点 工作量大 不能对目标种群进行原位和实时监测
一、微生物分子生态学的理论
1、传统培养法的瓶颈
微生物多样性被用于监视和预测环境变化,也是新基因 资源的重要来源。传统纯培养技术虽然已经帮助人们认 识了很多微生物，创造了巨大的财富，但是由于
什么原因？ 各种环境中能纯培养的微生物种类非常有限，远远不 能反映出自然界微生物多样性的丰度和范围。
2、微生物分子生态学的产生
核糖体区间序列多态性
优点
缺点
反映各种微 工作量大，成本高，不
生物种类构成
能对目标种群进行
和亲缘关系 原位和实时的检测
DNA片段纯化 后可以直接
用于测序
分辨率低，被分析的片 段不能大于400bp
同上
同上
操作比较简便 价格低廉
灵敏度和重现度差， 150～400bp最佳 的分离效果
分辨率高
对图谱进行定量化解析 和进行群落
环境微 生物群 落
生物化学 方法
微生物代谢 生理学方法
分子生物 学方法
呼吸醌指纹法 脂肪酸指纹法PLFA BIOLOG法 杂交法 宏基因组 基于16SrDNA方法 RADP、ERIC等 基因芯片技术
荧光原位杂交FISH 核酸探针杂交 16S rDNA克隆文库 DGGE / TGGE T-RFLP、ARDRA SSCP RFLP、RISA
Vinh D. Pham等人用16S rDNA文库结合fosmid方法研究 了阿拉斯加某中温油藏采出水中细菌和古细菌的多样性，结 果表明古细菌和细菌数量均等，未培养微生物约占检出总量 的30%左右，检测到的古细菌主要是乙酸型产甲烷古菌。
佘跃惠等人也用16S rDNA文库结合TGGE方法研究了大港 孔店油田注水油藏微生物群落的多样性，结果表明注水井中 的微生物多样性比采油井中丰富，注水井样品中的细菌主要 属于变形菌门和放线菌纲,尤其是红细菌亚纲(47%)。采油井 样品的细菌主要属于变形菌门,尤其是假单胞菌属(62%)。
间的比较都十分困难
方便快捷 分辨率高 灵敏度高
复杂群落多样性的低估、 影响因素多、
无法对微生物定性分析
操作简单、序 核糖体的拷贝数的不同
列多态性丰富
会产生假阳性
2、荧光原位杂交（ FISH ）
利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针，并 通过荧光直接标记或者荧光素偶联的抗原-抗体检 测系统，对DNA或RNA进行定性或定位分析。
肠杆菌基因间重复共有 序列在不同种属或
者同属的不同种微生物 之间的拷贝数和定
位的差异引起两个ERIC 之间序列的多态性
优点
缺点
过程简单 避免PCR偏差
操作简单， 可原位检测， 检测灵敏度高
影响杂交分析结果的 因素复杂，只能用来 检测事先已知其目标
基因序列的微生物
只能对特定类群的 微生物进行研究
信息量大 重复性高
2、基于16S rDNA的指纹图谱法
为什么选择16S rRNA基因作为微生物进化 的遗传标记?
方法：
• 16S rDNA克隆文库 / ARDRA • DGGE/TGGE • RFLP/T-RFLP • RISA（ITS） • SSCP
由于载体与DNA片段一一对应， 可得到单个DNA片段重组质粒，
系统进化关系
不同的变性剂浓 度，解链之后电泳速度
将会急剧下降 温度梯度，利用不同序
列结构的DNA，双链 具有不同的熔点温度Tm 长度相同但序列不同的
单链DNA具有空间构 象上的差异
16S rDNA序列的差异， 限制性核酸内切酶酶切
后将得到长度与数量 不同的DNA片段
PCR扩增中所用引物的 一端或两端带有荧光 标记
农学系生物技术专业课程《微生物学研究进展》
第五章 分子生态学方法在环境 微生物研究领域的应用
一、微生物分子生态学的理论 二、微生物分子生态学的研究方法 三、展望
墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所 属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先 估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。
⑴ 构建16S rDNA克隆文库 转化时过程中绝大多数感受态 细胞只能接受一个外源DNA分 子，由此便可达到把混合片段 分开的目的
环境样品
提基因组
阳性克隆鉴定 PCR扩增所有 16SrDNA片段
扩增混合基因 组16SrDNA
挑取单克隆鉴定 酶切、PCR方法 是否为阳性克隆 鉴定
ARDRA
全部阳性克隆测序
1、研究路线
分析 方法
分子 杂交
其它 分子 生物
学 方法
方法 类别 核酸 探针 杂交
FISH
RFLP
RAPD
ERIC
原理Байду номын сангаас
DNA的变性、复性及其 在复性过程中的碱基
配对原则、探针与 靶分子的特异性结合
人工合成的荧光或放射 性标记探针与微生 物基因组杂交
序列差异引起限制性内 切酶 酶切位点 的差异
利用随意设计的 非特异引物
周期长，过程繁琐
简单、迅速
重复性低
结果稳定 重复性好 灵敏度高
PCR反应本身的扩增和 偏差可能会产生假
阳性，不能对群落中 感兴趣的菌进一步研究
分析 方法 基于 16S rDNA
的 方法
方法 类别 16S rDNA 克隆 文库 DGGE
TGGE
SSCP
ARDRA
TRFLP RISA
原理
可以用来揭示 不同物种的
为了突破传统纯培养方法的限制，必须要 有一种能绕过纯培养这一步的新技术，来 推动微生物多样性的研究。
微生物分子生态学的产生使得微生物群落的 研究由细胞水平深入到分子机制研究水平,提 出了微生物分子进化和分子适应等全新概念, 使微生物生态学理论更加接近自然本质。
3、微生物分子生态学的概念
利用分子生物学技术手段研究自然界微生物与 生物及非生物环境之间相互关系及其相互作用规律 的科学。
墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所 属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先 估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。
二、微生物分子生态学的研究方法
两种或两种以上四碱 基限制性内切酶酶切
与载体连接，转 入感受态细胞
与数据库 序列比对
系统发 育分析
微生物群落 结构信息
内切酶图谱分型
序列比对及分析
每种类型挑选1-3个 克隆测序
•优点 得到的序列信息比较完整 片段携带的信息量大，结果可靠 适合对环境中微生物群落的整体结构进行分析
•缺点 工作量大 不能对目标种群进行原位和实时监测
一、微生物分子生态学的理论
1、传统培养法的瓶颈
微生物多样性被用于监视和预测环境变化,也是新基因 资源的重要来源。传统纯培养技术虽然已经帮助人们认 识了很多微生物，创造了巨大的财富，但是由于
什么原因？ 各种环境中能纯培养的微生物种类非常有限，远远不 能反映出自然界微生物多样性的丰度和范围。
2、微生物分子生态学的产生
核糖体区间序列多态性
优点
缺点
反映各种微 工作量大，成本高，不
生物种类构成
能对目标种群进行
和亲缘关系 原位和实时的检测
DNA片段纯化 后可以直接
用于测序
分辨率低，被分析的片 段不能大于400bp
同上
同上
操作比较简便 价格低廉
灵敏度和重现度差， 150～400bp最佳 的分离效果
分辨率高
对图谱进行定量化解析 和进行群落
环境微 生物群 落
生物化学 方法
微生物代谢 生理学方法
分子生物 学方法
呼吸醌指纹法 脂肪酸指纹法PLFA BIOLOG法 杂交法 宏基因组 基于16SrDNA方法 RADP、ERIC等 基因芯片技术
荧光原位杂交FISH 核酸探针杂交 16S rDNA克隆文库 DGGE / TGGE T-RFLP、ARDRA SSCP RFLP、RISA
Vinh D. Pham等人用16S rDNA文库结合fosmid方法研究 了阿拉斯加某中温油藏采出水中细菌和古细菌的多样性，结 果表明古细菌和细菌数量均等，未培养微生物约占检出总量 的30%左右，检测到的古细菌主要是乙酸型产甲烷古菌。
佘跃惠等人也用16S rDNA文库结合TGGE方法研究了大港 孔店油田注水油藏微生物群落的多样性，结果表明注水井中 的微生物多样性比采油井中丰富，注水井样品中的细菌主要 属于变形菌门和放线菌纲,尤其是红细菌亚纲(47%)。采油井 样品的细菌主要属于变形菌门,尤其是假单胞菌属(62%)。
间的比较都十分困难
方便快捷 分辨率高 灵敏度高
复杂群落多样性的低估、 影响因素多、
无法对微生物定性分析
操作简单、序 核糖体的拷贝数的不同
列多态性丰富
会产生假阳性
2、荧光原位杂交（ FISH ）
利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针，并 通过荧光直接标记或者荧光素偶联的抗原-抗体检 测系统，对DNA或RNA进行定性或定位分析。
肠杆菌基因间重复共有 序列在不同种属或
者同属的不同种微生物 之间的拷贝数和定
位的差异引起两个ERIC 之间序列的多态性
优点
缺点
过程简单 避免PCR偏差
操作简单， 可原位检测， 检测灵敏度高
影响杂交分析结果的 因素复杂，只能用来 检测事先已知其目标
基因序列的微生物
只能对特定类群的 微生物进行研究
信息量大 重复性高
2、基于16S rDNA的指纹图谱法
为什么选择16S rRNA基因作为微生物进化 的遗传标记?
方法：
• 16S rDNA克隆文库 / ARDRA • DGGE/TGGE • RFLP/T-RFLP • RISA（ITS） • SSCP
由于载体与DNA片段一一对应， 可得到单个DNA片段重组质粒，
系统进化关系
不同的变性剂浓 度，解链之后电泳速度
将会急剧下降 温度梯度，利用不同序
列结构的DNA，双链 具有不同的熔点温度Tm 长度相同但序列不同的
单链DNA具有空间构 象上的差异
16S rDNA序列的差异， 限制性核酸内切酶酶切
后将得到长度与数量 不同的DNA片段
PCR扩增中所用引物的 一端或两端带有荧光 标记
农学系生物技术专业课程《微生物学研究进展》
第五章 分子生态学方法在环境 微生物研究领域的应用
一、微生物分子生态学的理论 二、微生物分子生态学的研究方法 三、展望
墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所 属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先 估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。
⑴ 构建16S rDNA克隆文库 转化时过程中绝大多数感受态 细胞只能接受一个外源DNA分 子，由此便可达到把混合片段 分开的目的
环境样品
提基因组
阳性克隆鉴定 PCR扩增所有 16SrDNA片段
扩增混合基因 组16SrDNA
挑取单克隆鉴定 酶切、PCR方法 是否为阳性克隆 鉴定
ARDRA
全部阳性克隆测序
1、研究路线
分析 方法
分子 杂交
其它 分子 生物
学 方法
方法 类别 核酸 探针 杂交
FISH
RFLP
RAPD
ERIC
原理Байду номын сангаас
DNA的变性、复性及其 在复性过程中的碱基
配对原则、探针与 靶分子的特异性结合
人工合成的荧光或放射 性标记探针与微生 物基因组杂交
序列差异引起限制性内 切酶 酶切位点 的差异
利用随意设计的 非特异引物
周期长，过程繁琐
简单、迅速
重复性低
结果稳定 重复性好 灵敏度高
PCR反应本身的扩增和 偏差可能会产生假
阳性，不能对群落中 感兴趣的菌进一步研究
分析 方法 基于 16S rDNA
的 方法
方法 类别 16S rDNA 克隆 文库 DGGE
TGGE
SSCP
ARDRA
TRFLP RISA
原理
可以用来揭示 不同物种的
为了突破传统纯培养方法的限制，必须要 有一种能绕过纯培养这一步的新技术，来 推动微生物多样性的研究。
微生物分子生态学的产生使得微生物群落的 研究由细胞水平深入到分子机制研究水平,提 出了微生物分子进化和分子适应等全新概念, 使微生物生态学理论更加接近自然本质。
3、微生物分子生态学的概念
利用分子生物学技术手段研究自然界微生物与 生物及非生物环境之间相互关系及其相互作用规律 的科学。