生物药药代分析方法

国外医学药学分册
2006年
2月　第
33卷第
1期·63·


蛋白多肽类药物的药代动力学分析方法的研究进展

孙会仙综述　张淑珍
,谢剑炜
3
审校
(军事医学科学院毒物药物研究所
,北京
100850)

摘要
:蛋白多肽类药物的药代动力学与传统药物不同
,目标蛋白多肽给药量小
,而各种内源性蛋白
含量很高
,这种干扰使准确测量目标分子非常困难。此类研究必须以建立灵敏、专一、准确的测定
方法为前提。本文综述了近年来研究蛋白多肽类药物的药代动力学各种分析方法
,包括生物检定
法、同位素标记示踪法、免疫分析法、液相色谱、气相色谱、毛细管电泳、质谱、核磁共振、液相色谱
质谱
(LC2MS)和毛细管电泳
2质谱
(CE2MS)联用技术等
,其中
LC2MS和
CE2MS联用技术可望成为较
2
有前途的分析方法。
关键词
:蛋白多肽类药物
;药代动力学
;分析方法
中图分类号
: R972　文献标识码
:A　文章编号
: 100120971 (2006) 0120063204

治疗药物的应用等。近年来,人们已能生产出多种
蛋白多肽类药物,同时,人们还通过对该类药物进行
结构修饰以提高疗效、延长体内半衰期,所有这些工
主要分为两类
:在体分析和体外组织
(细胞
)分析。
在体分析最能直观地反映生物活性
,但需要动物模

蛋白多肽类药物对维持机体的正常功能具有重胞)对被测定活性蛋白多肽的某种特异反应
,通过剂
要作用
,并可用于治疗严重威胁人类健康的肿瘤、
作显著促进了此类药物的研究开发。
一级结构,与其二级和三级结构亦密切相关。方法
病量
(或浓度
)效应曲线实现对目标蛋白多肽的定量分
毒性肝炎、艾滋病及一些自身免疫性疾病
,还有
析。蛋白多肽类药物的生物活性不仅取决于药物的
SARS病毒早期快速诊断的蛋白芯片、
SARS疫苗和


目前
,蛋白多肽类药物药代动力学研究的最大
的瓶颈表现在两个方面
: (1)蛋白多肽和内源性蛋白
多肽都由氨基酸组成
,结构性质相似
,难以分离、提
取和纯化
; (2)在药代动力学研究中
,目标蛋白多肽
给药量小
,血药浓度极低
,而各种内源性蛋白含量要
高出数千上万倍
,这种干扰使目标分子的有效提取
和准确测量非常困难。然而
,现代科学技术的飞速
发展为此类药物的药代动力学研究提供了多种分析
手段
,如生物检定法、同位素标记示踪法、免疫分析
法、液相色谱
(LC)、毛细管电泳
( CE)、气相色谱
(GC)、质谱
(MS)、核磁共振
(NMR)、液相色谱
2质谱
(LC2MS)和毛细管电泳
2质谱
(CE2MS)联用技术等。


1　生物检定法

生物检定法的原理是通过在体或体外组织

(细

　收稿日期
:2005205219

　作者简介
:孙会仙
(1975-) ,女
,在读硕士研究生
,研究方向
:药物
分析
,Tel :010********* ,E-mail :sunhuixx @chinaren. com

　3通讯作者
:谢剑炜
,男
,研究员
,博士生导师
,研究方向
:药物分
析
,Tel :010-********

型和外科手术
,耗时且观察结果有主观性
,变异性
大
,灵敏度低。用细胞测定的方法花费少且省时
,特
别是随着分子生物学技术的发展
,细胞培养成常规
手段
,已建立了特异性强、灵敏度高的生物检定法。


2　同位素标记示踪法

同位素标记示踪法是通过在目标蛋白多肽上标
记同位素而鉴别目标蛋白多肽的方法
,为活性蛋白
多肽药代动力学研究的主要手段之一
,灵敏度高
,并
可获得药物吸收、分布、代谢和排泄的全面信息。
Liu等[1]用碘化法
(iodogen)制备
[125 I]西夫韦肽
(sifu2
virtide) ,大鼠单次给药后
,用三氯醋酸
( TCA)沉淀法
测定血浆或组织中的放射性含量
,结果在给药剂量
范围内呈线性动力学关系
,TCA沉淀法测得泌尿系
统和胃肠道系统放射性最高
,[125 I]西夫韦肽主要经
肾脏排泄
,为临床上合理和安全地应用西夫韦肽提
供药代动力学资料。

然而
,该方法在分析蛋白多肽类药物时存在一
些缺点
:随着方法的复杂化
,灵敏度、重现性和回收
率受到影响
;不能进行人体药代动力学研究
;同位素
标记后可能会引起药物的生物活性及其在生物体内
的代谢行为发生变化
;由于蛋白多肽类药物进入体




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内会被降解代谢
,或与其他蛋白质结合
,总的放射性
强度不能代表药代动力学过程。


3　免疫分析法

蛋白多肽类药物具有免疫原性
,因此
,可以采用
免疫分析法测定生物体液中的蛋白多肽类药物。常
用的免疫分析方法有放射免疫分析
(RIA)、免疫放
射分析
( IRMA)和酶联免疫吸附测定
( ELISA)等。而
其中
,ELISA最为常用
,具有灵敏度高、特异性强、高
效、非放射性、重复性好、批量测定等优点
[2]。免疫
学方法的缺点是不能同时测定代谢物
,具有抗原决
定簇的代谢片段可能会增加实验结果误差
;不同来
源的抗体与相同的蛋白多肽反应可能有较大的差
别
;可能受到内源性物质的干扰。当免疫分析法与
其他分离技术联用时可以解决某一缺点
,例如
,
Hartmann等[3]用
LC法结合
RIA技术对胰高血糖激
素类似肽
( GLP)22的体内外代谢物进行了分离及鉴

定,解决了单独用RIA法导致的交叉免疫反应。
4　液相色谱法
反相高效液相色谱(RP2)是分离纯化蛋白
扩散系数成反比,而蛋白

质和多肽具有扩散系数小
的特点,这意味着CE非常适合于蛋白质及多肽的
分析研究。毛细管区带电泳(CZE)适用于带电溶质
的分离,而非离子型溶质则选择胶束电动毛细管色
谱(MECC)。在缓冲液中加入一些能与样品产生相
互作用的添加剂,如环糊精、有机溶剂或金属离子等
会进一步改善分离效果。Lacher等[7 ]用CE分析血
管紧张素及其代谢物,缓冲液内加入的Cu ( Ⅱ)可使
其配位络合,从而使样品得到了很好的分离。Zhang
等[8 ]则采用加压毛细管电色谱(CEC)分离多肽,在
分离复杂样品时比等压力CEC具有更好的效果。
CE的高分离性能和超微量进样成为药物分离分
析的一大优势,但该方法也存在检测灵敏度不足和重
现性差等问题。如扩大毛细管检测部位的体积或延
长毛细管的吸收光路可以使灵敏度提高1～2个数量
级;根据等速电泳原理进行的柱上浓缩可以使分析的
灵敏度提高上百倍甚至数万倍;在线固相微萃取或隔
膜预富集等技术的应用,可以大大缩短分析时间,提
高灵敏度,Chen等[9 ]研究了大鼠血浆脑啡肽(DPDPE)
多肽类药物最有效的方法之一
55 %蛋白多肽总数的
,占
LC法分离研究
以上
,实践证明
, RP2HPLC对
蛋白多肽类药物具有较高的分离效能
,且蛋白多肽
保留时间与其疏水
2亲水性有关。
Gallwitz等[4]研究
了
GLP21的
N端
1位氨基酸结构修饰物被二肽酶
Ⅳ
的酶解情况
,酶解后的代谢物经
RP2HPLC分析
,结
果表明
,除了
α2甲基
2GLP21外
,其他
GLP21的
N端氨
基酸结构修饰物对二肽酶
Ⅳ都比较稳定。
Wen等[5]
报道了促黄体生成激素释放激素
(LHRH)在负鼠五
个不同部位、新鲜和冷冻的肠粘膜匀浆内的代谢情
况
,代谢物经
RP2HPLC分析
,从色谱图上可观察到
LHRH色谱峰逐渐降低
,同时伴随着碎片峰逐渐增
大
,从而推断不同部位肠粘膜匀浆对其代谢差异。
Besser等[6]用
RP2HPLC分析了生长抑素
( somato2
stain)214和结构修饰物在大鼠肝匀浆内的代谢情
况
,表明生长抑素
214在肝匀浆
1h内完全降解
,而
经碳骨架环化后的修饰物对肝匀浆水解酶更加稳
定
,15 h内没有发现样品峰的降低及碎片峰的产生。


5　毛细管电泳法


CE具有高分辨率、分析时间短、样品用量少及
操作简单等诸多优点。毛细管的柱效与样品分子的

的定量方法
,用荧光试剂
TRITC对其进行衍生化
,CE2
LIF的最低检测限可达
1. 3 ×10 -9 mol·L-1,满足了药
代动力学测定的要求。


6　质谱法


MS在研究物质组成和结构方面一直占有极其
重要的地位
,可以提供化合物的相对分子质量
( Mr)
及丰富的结构信息。传统的
MS离子化方法包括电
子轰

击和化学电离
,不适于难挥发和热不稳定的强
极性物质的测定
,因而对生物大分子的测定无能为
力。新的软电离技术的诞生
,如快原子轰击
( FAB)、
电喷雾电离
( ESI)和基质辅助激光解吸电离
(MALDI) ,使得可能在
μmol·L-1甚至
nmol·L-1的水
平上准确分析
Mr高达几万到几十万的生物大分
子
,将这些软电离技术与
MS2MS相结合可以获得蛋
白质、多肽分子的结构信息
,因此
,在蛋白质、多肽等
大分子物质的分析领域中得到了广泛应用。


FAB2MS测定多肽的氨基酸序列具有用量少、方
便和快速的优点。
ESI2MS由于可以产生多电荷峰
,
与传统
MS相比扩大了检测的
Mr范围
,可以得到准
确的
Mr,因此特别适合分析蛋白多肽类药物。
García2Garayoa等[10 ]用
ESI2MS对放射性标记的神经



高灵敏度;另外,对蛋白多肽类药物进行衍生化,采用
激光诱导荧光检测器(LIF)进行检测,可以极大地提

发挥重要的作用。
7. 1　液相色谱2质谱法
国外医学药学分册
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1期·65·


降压肽
(neurotensin) 8～13及其类似物的体内外代谢
物进行了鉴定。
ESI2MS的最大优势是可直接与
LC
和
CE联用
,在线分析酶解后碎片
,其主要缺陷是不
易处理复杂的混合物。
MALDI2MS为分析非挥发
性、热不稳定的大分子提供了一种较好的离子化方
式。它的最大优点是允许样品中含有数百
mmol ·
L-1缓冲液及盐
,以及其他非挥发性成分及去垢剂
,
且灵敏度比其他离子化方式高
,并可对混合样品进
行直接分析。
MALDI2MS能有效地分析蛋白多肽类
药物的代谢物
,并能给出精确的
Mr。Wen等[11 ]分
析了
LHRH在负鼠胃肠粘膜中的代谢物
,代谢物经
RP2HPLC分离
,UV检测
,人工收集每个峰的流出物
进行
MS鉴定
( MALDI2TOF2MS或
ESI2Q2MS)。


7　联用技术

色谱法的肽谱分析只能给出肽段在
LC上的分
离图谱
,而不能对每一肽段进行定性鉴定
,除非再收

集每一肽段进行序列分析,这需要较大的工作量,且
在处理过程中,经常会使样品中的一些组分丢失。
而各种色谱2质谱联用技术(LC2MS和CE2MS)对于
复杂体系分离分析十分有效,在药代动力学研究中
准确、精密、灵敏而快速地完成。柱切换法是将前处
理用色谱柱或其他装置和分析用色谱柱在线连接,
从而实现在线分离。Dai等[14 ,15 ]研究设计并优化了
在线SPE2LC2MS自动化分析系统,即适用于高度复
杂的血浆、血清样品制备的在线分流进样模式
(OSIM)方式和相对简单的生物样品如尿样的直接
进样模式(DIM)方式,有效地解决了该类研究中经
常遇到的萃取柱使用寿命、大体积样品前处理、萃取

效率和重现性等问题,在猕猴单次皮下或静脉注射
西夫韦肽的药代动力学研究中,利用OSIM2SPE2LC2
MS2MS系统,单一固相萃取柱,成功地测定了300多
个血浆样品。
7. 2　毛细管电泳2质谱法
目前,CE的高效分离与MS的高鉴定能力相结
合已成为微量生物样品尤其是蛋白质、多肽分离分
析的强有力工具,可提供Mr及结构信息。Ensing
等[16 ]用CE2MS分离并鉴定了神经肽Y(NPY)及其两
个碎片的结构,能区分仅有一个氨基酸差别的多肽,
而在常规的CE2UV上仅能看到一个峰。Cao等[17]用
CE2ESI2TOF2MS分析了血红蛋白(hemoglobin)2S及其
胰酶酶解产物,并对三种毛细管柱和不同的入口压力
LC2MS联用技术在选择性、灵敏度、
Mr测定和
提供结构信息等方面具有明显的优势
,能够同时获
得可靠的定性和定量结果
,国外已将
LC2MS用于蛋
白多肽类药物的药代动力学研究。
Sandin等[12 ]用
RP2HPLC2ESI2MS和分子排阻色谱
(SEC)2LC2ESI2MS
分析了内啡肽
(BEND)在人类血浆中的酶解情况
,并
用
MS2MS对其酶解碎片进行了多肽序列分析
,结果
显示
,BEND(1～19)和
BEND (20～31)是其主要的两
个碎片。
Feng等[13 ]采用
LC2MS2MS技术
,研究了缓
激肽拮抗剂
(B201)在大鼠体内的药代动力学性质
,
以及体外大鼠血浆和磷酸盐缓冲液中的稳定性。线
性范围为
2. 5～1 500μg·L-1,最低检测限
(LOD)为


0. 25μg·L-1,最低定量限
(LOQ)为
2. 5μg·L-1,低、
中、高浓度的相对标准偏差
(RSD)和回收率均满足
药代动力学的要求。
用
LC2MS法测定生物样品中的药物及其代谢
物时
,需要进行蛋白沉淀、液相或固相萃取
(SPE)等
前处理操作
,既费时又会影响结果准确性和精密度。
采用浸透限制的固定相、含有表面活性剂的流动相、
柱切换法等技术可以简化这种操作
,使整个过程能

对分析时间及分辨率的影响进行了比较研究。
Li
等[18 ]报道了芯片
2CE2ESI2MS和芯片
2CE2MS2MS用于
蛋白多肽类药物的分析
,与
CE2MS法相比较
,具有更
高的灵敏度和选择性
,分析时间明显缩短。
Preisler
等[19 ]采用真空沉积接口把
CE和
MALDI2TOF2MS连
接起来分析了血管紧张素混合物和烯醇酶的酶解代
谢物
,并获得了较高的分离效率及较低的检测限。目
前
,CE2MS没有
LC2MS发展成熟
,可以期待其在蛋白
多肽类药物的研究方面有更广泛的应用。


8　其他技术


8. 1　气相色谱法
GC适合分析在
GC进样口温度条件下能气化
或有一定蒸汽压
,或经衍生化后有一定蒸汽压的样
品。
GC2MS是一种比较成熟的技术
,Yi等[20 ]开展了
其在多肽类药物分析中的应用。在医药研究领域
中
,仅有约
20 %的药物可用
GC分析

,其中多数还必
须经过衍生化步骤
,因此局限性较大。


8. 2　核磁共振法
随着二维、三维及四维
NMR的应用
,以及分子
生物学、计算机处理技术的发展
,NMR逐渐成为蛋
白多肽类药物分析的主要方法。
NMR可用于氨基




互为补充和验证。互为补充和验证。
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Foreign Medical Sciences Section of Pharmacy　2006 Feb; 33(1)
酸序列、定量混合物中各组分含量等的分析。近年
来
,LC2NMR联用技术在研究代谢产物
,特别是
Ⅱ相
代谢产物方面表现出了非常诱人的前景
[21 ]。LC2
NMR2MS的联用实现了两种检测手段
NMR和
MS的
相互补充
,为解析复杂的药物结构提供了全面信息。


9　结语

目前
,蛋白多肽类药物的药代动力学分析方法
有
10余种
,其中
,生物检定法发展较早
,但灵敏度
低
;同位素标记示踪法及免疫分析法较为复杂
;色谱
法应用较为普遍
,但不能提供结构信息
;而以
LC2
ESI2MS、LC2MALDI2TOF2MS及
CE2MS等为代表的分
析技术的不断完善和发展
,既可以分离样品及其代
谢物
,又可以提供分子结构及
Mr信息
,为蛋白多肽
类药物的药代动力学研究提供了必要的技术手段。
近年来
,随着生命科学的蓬勃发展
,使蛋白多肽类药
物的研发成为一个崭新的研究领域
,鉴于该类药物

的特殊性,目前尚无一种完全满足蛋白多肽类药物
的药代动力学研究所要求的分析方法,应按具体情
况,通常将几种方法联合使用,
rized capillary electrochromatography [J ] . J Chromatogr A , 2003 ,
987(1/ 2) :453 -458.
[9 ]　Chen C , Jeffery D , Jorgenson JW , et al . Sensitive analysis of [ D2
Pen2 ,5 ] enkephalin in rat serum by capillary electrophoresis and lase2
rinduced fluorescence detection[J ] . J Chromatogr B Biomed Sci Ap2
pl , 1997 , 697 (1/ 2) :149 -162.
[10 ]　García2Garayoa E , Allemann2Tannahill L , Bl.uenstein P , et al .
In vitro and In vivo evaluation of new radiolabeled neurotensin(8 -13)
analogues with high affinity for NT1 receptors[J ] . Nucl Med Biol ,
2001 , 28(1) :75 -84.
[11 ]　Wen J , Davies N , Ledger R , et al . Isocratic liquid chromatographic
assay for monitoring the degradation of luteinizing hormone releasing
hormone by extracts from the gastrointestinal tract of possums[J ] . J
Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci , 2002 , 779(2) :221 -227.
[12 ]　Sandin J , Nylander I , Silberring J . Metabolism of β2endorphin in
plasma studied by liquid chromatography2electrospray ionization mass
spectrometry[J ] . Regul Pept , 1998 , 73 (1) :67 -72.
[13 ]　Feng WY, Chan KK, Covey JM. Electrospray LC2MS/ MS quantita2
tion , stability , and preliminary pharmacokinetics of bradykinin anta2
gonist polypeptide B201 (NSC 710295) in the mouse[J ] . J Pharm
Biomed Anal , 2002 , 28 (3/ 4) :

601 -612.
[14 ]　Dai SJ , Song HF , Dou GF , et al . Quantification of sifuvirtide in
monkey plasma by an on2line solid2phase extraction procedure com2
bined with liquid chromatography/ electrospray ionization tandem mass
spectrometry[J ] . Rapid Commun Mass Spectrom , 2005 , 19 (10) :
[1]　LiuDS,MengZY,Zhao GS,
参
et al . Pharmacokineticsof [125I]sifuvir2
tide in rats[J ]. Chin J Pharmacol Toxicol , 2005 , 19(4) :296 -299.
[2]　Lambiase A , Tirassa P , Micera A , et al . Pharmacokinetics of con2
junctivally applied nerve growth factor in the retina and optic nerve of
adult rats[J ]. Invest Ophthalmol Vis Sci , 2005, 46 (10) :3800 3806.
[3]　Hartmann B , Harr MB , Jeppesen PB , et al . In vivo and in vitro
degradation of glucagon2like peptide22 in humans[J ]. J Clin En2
docrinol Metab , 2000 , 85 (8) :2884 -2888.
[4]　Gallwitz B , Ropeter T , Morys2Wortmann C , et al . GLP212analogues
resistant to degradation by dipeptidyl2peptidase Ⅳ
in vitro[J ]. Regul
Pept , 2000 , 86 (1 -3) :103 -111.

[5]　Wen JY, Ledger R, McLeod BJ , et al . Enzymatic degradation of
luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) by mucosal ho2
mogenates from the intestine of the common brushtail possum ( Tri2
chosurus vulpecula) [J]. Life Sci , 2002 , 71 (25) :3019 -3030.
[6]　Besser D , Muller B , Kleinwachter P , et al . Synthesis and characterization
of octapeptide somatostatin analogue with backbone cycliza2
tion : comparison of different strategies , biological activities and enzy2
matic stabilities[J ] . J Prakt Chem , 2000 , 342 (6) :537 -545.
[7]　Lacher NA , Garrison KE , Lunte SM. Separation and detection of an2
giotensin peptides by Cu ( Ⅱ) complexation and capillary elec2
trophoresis with UV and electrochemical detection[J ]. Electrophore2
sis , 2002 , 23 (11) :1577 -1584.
[8]　ZhangK,JiangZ, YaoC, et al . Separation of peptides by pressu1273
-1282.

[15 ]　Dai SJ , Dou GF, Qiang XH, et al . Pharmacokinetics of sifuvirtide ,
a novel anti2HIV21 peptide , in monkeys and its inhibitory concentra2
tion in vitro[J ]. Acta Pharmacol Sin , 2005 , 26 (10) :1274 -1280.
[ 16 ]　Ensing K, deBoer T, SchreuderN, et al . Separation and identifica2
tion of neuropeptide Y, two of its fragments and their degradation
products using capillary electrophoresis2mass spectrometry [ J ] . J
Chromatogr B Biomed Sci Appl ,1999,727 (1/2) :53-61.
[17 ]　Cao P , Moini M. Pressure2assisted and pressure2programmed capil2
lary electrophoresis/ electrospray ionization time of flight2mass spec2
trometry for the analysis of peptide mixtures [ J ] . Electrophoresis ,
1998 , 19(12) :2200 -2206.
[ 18 ]　Li J , Thibault P , Bings NH , et al . Integration of microfabricated de2
vices to capillary electrophoresis2electrospray mass spectrometry using
a low dead volume connection : application to rapid analyses of prote2
olytic digests[J ] . Anal Chem , 1999 , 71 (15) :3036 -3045.
[19 ]　Pre

isler J , Hu P , Rejtar T , et al . Capillary electrophoresis2matrix2
assisted laser desorption/ ionization time2of2flight mass spectrometry
using a vacuumdepositioninterface[J]. Anal Chem , 2000 , 72 (20) :
4785 -4795.
[20 ]　Yi D , Smythe GA , Blount BC , et al . Peroxynitrite2mediated nitra2
tion of peptides : characterization of the products by electrospray and
combined gas chromatography2mass spectrometry[J ]. Arch Biochem
Biophys , 1997 , 344 (2) :253 -259.
[21 ]　Peng SX. Hyphenated HPLC2NMR and its application in drug disco2
very[J ] . Biomed Chromatogr , 2000 , 14 (6) :430 -441.
考文献