嗜麦芽窄食单胞菌基因同源性分析_吴锦

◇临床医学◇
嗜麦芽窄食单胞菌基因同源性分析
吴
锦1，胡立芬1，2，沈为华2，朱玉林2，刘艳艳2，李家斌
2(1．安徽医科大学第一附属医院中心实验室;2．安徽医科大学细菌耐药研究所，安徽合肥230022)
摘要：目的
了解2005—2010年安徽省临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌并通过基因同源性分型，推测菌株地流行性趋势，为控制
医院感染的发生提供科学的理论依据。

方法收集安徽省细菌耐药监控网中的34家不同级别医院2005—2010年（每年9月1日—30日）临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌188株，采用全自动微生物分析仪对标本进行重新鉴定。

提取全基因组DNA ，应用随
机引物PCR 方法对菌株进行基因分型分析菌株克隆流行传播情况。

结果对188株基因分型，发现2005、2007及2009年的菌株均表现不同的基因亚型；2006年678和702号、2008年的824和826号、2010年的186和18号菌株分别是同一基因亚型，追
踪临床资料发现它们均来自于同一医院同一科室，说明可能存在同一克隆株在院内传播的情况。

结论同一克隆株的嗜麦芽窄食单胞菌在同一医院同科室的出现，提示该菌有造成医院感染流行的隐患，因此临床医生在控制基础疾病抗感染的同时，应该高度警惕此菌的存在，及时采取措施，减少该菌的临床感染及流行。

关键词：嗜麦芽窄食单胞菌；基因同源性；聚合酶链反应
Detection of β-lactamase and quinolone resistance gene in
Stenotrophomonas maltophilia
WU Jing 1，HU Li-fen 1，2
，SHEN Wei-hua 2，et al
（1．The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University ；2．Institute of Bacterial Resistance
in Anhui Medical University ，Hefei ，Anhui 230022，China ）
Abstract ：Objective
To investigate the epidemiology by genotyping among isolates ，in order to provide a scientific basis for the control
of nosocomial infection．Methods
In this study ，during the month of September from 2005to 2010，188clinical S．maltophilia isolates
were collected from 34different graded hospitals which were the members of Anhui Center for Surveillance of Bacterial Resistance．The i-solates were identified by using the Microscan Walkaway-40System．Total DNA of the 102clinical isolates from 2005to 2008collection was extracted by suspending several overnight colonies in 0．5mL of double-distilled water and heating the mixture at 100ħfor 10min．The epidemic spread of S．maltophilia isolates was detected by random primer PCR method for genotyping．Results
By genotyping of the
188isolates ，we found that all the isolates in 2005，2007and 2009showed different geneotypes ，but isolate 678and 702in 2006，isolate 824and 826in 2008，isolate 186and 187in 2010shared the same geneotypes respectively．After tracking clinical data we found that they were from the same department in the same hospital respectively．Our results revealed that cross-colonization might be possible among the patients who are followed up at the same center．Conclusions
The occurrence of the same geneotype isolates in the same department
suggests that the bacteria have the risk of causing nosocomial infection epidemic．Therefore ，clinicians should be aware of the bacteria in control underlying debilitating diseases of patients ，and take measures to reduce the infection of the bacteria．Key words ：Stenotrophomonas maltophilia ；geneotype ；PCR 基金项目：国家自然科学基金（No 81101313；No 81172737）
通信作者：李家斌，男，教授，博士生导师，研究方向：临床细菌耐药机
制，
E-mail ：lijiabin948@vip．sohu．com 嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas Maltophilia ，
SMA ）属于非发酵菌，随着各种抗菌药物在临床中的广泛使用及辅助医疗设备对人体有创治疗的进展，该菌的感染率不断上升，已成为医院感染的重要病原菌之一，主要导致身体衰弱患者和免疫受损患者的院内感染，它的临床致病性越来越受到重视。

为了进一步提高对嗜麦芽窄食单胞菌医院感染的预防和诊治水平，本研究通过基因同源性分型，推测菌株地流行性趋势，为控制医院感染的发生提供科学的理论依据。

1材料与方法
1．1
菌株来源与分离鉴定
收集2005—2010年6年期间9月份安徽省临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌188株（不包括6
名感染者二次分离的菌株），菌株主要来源于呼吸科、血液内科、胸腹外科、急诊ICU 、血透科、消化内科等，质控菌株ATCC 27853，大肠埃希菌ATCC 25922均由安徽省细菌耐药性中心保存。

1．2
主要仪器与试剂Mueller-Hinton （M-H ）培养基，琼脂粉
等均购自英国Oxiod 公司。

多点接种仪（AQS Manufacturing
公司，英国）、电热恒温培养箱（上海精宏公司）、细菌比浊仪器（Oxiod ，英国）、超低温冰箱（日本三洋制冷设备公司）、移液器（Eppendorf 公司，德国）、一次性玻璃试管及一次性细菌
培养皿（杭州爱思进生物技术有限公司）。

ND-1000紫外分光光度计（基因公司，美国），DNA 扩增仪（Biometra 公司，德
国），电泳仪（北京六一仪器厂DYY．10C 型），凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司），引物由上海生工公司合成；ExTaqDNA 聚合酶、dNTPs 、Taq buffer 、loading buffer 和DNA marker 均购自大连宝生物公司，琼脂糖购自美国Invitrogen 公
·
34·安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2013Jan ;17(1)
司。

5ˑTBE 电泳缓冲液按照分子克隆标准配制，使用前稀释成1ˑTBE ；溴酚蓝由PCR 试剂盒附送；溴化乙锭干粉购自Sigma 公司，按照分子克隆标准配制；DNA Markers 购自大连宝生物公司。

1．3
RAPD-PCR （Randomly Amplifiled Polymorphic DNA ）
法分析菌株基因型参照文献［1］
由上海生工公司合成如下
随机引物：ERIC2（5＇ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC3＇），M13（5＇GAGGGTGGCGGTTCT 3＇）。

用煮沸法提取细菌总DNA 。

PCR 反应采用大连宝生物工程公司的PCR 反应试剂盒进行
DNA 扩增。

扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统观察拍照。

2RAPD-PCR 分析菌株同源性结果
用肉眼观察各菌株RAPD-PCR 产物1%的琼脂糖凝胶电泳条带数，不考虑每个电泳条带灰度值大小，不同菌株电泳条带数目和位置都相同被视为同一基因亚型，非同一基因型的菌株可产生不同的RAPD 图谱，
可按此图谱的不同将它们区分开来。

2005、
2007及2009年9月份的菌株的菌株均表现不同的基因亚型；2006年678和702号菌株是同一基因亚型，因此说明这家医院有同一克隆株的传播；2008年的824和826号菌株是同一基因亚型，追踪临床资料菌株824和826号菌
株来自同一医院ICU 病房的不同病人，
因此说明这家医院的ICU 病房有同一克隆株的传播；2010年的186和187号菌株
也是同一基因亚型，
186和187号菌株来自同一医院新生儿科的不同病人，说明这家医院的新生儿科当时存在同一克隆
株的传播。

不同年份的部分菌株基因型见图1 6。

3
讨论
嗜麦芽窄食单胞菌广泛分布于自然界中，特别是在潮湿的环境中易于生长繁殖，在河水、污水、自来水、植物、食物中等都可生存
［2］
，2008年Lisa 等科学家把嗜麦芽窄食单胞菌基
因组序列公布后不久英国媒体发表声明描述这个有机体是“
在医院里增加了人类对疾病高死亡率的恐惧并且是没有抗
图1
2005年部分菌株基因分型图
注：1 19分别代表2005年收集的不同菌株，15、16是同一病人不同时间收集的标本，
M 是marker2000。

图22006年部分菌株基因分型图
注：1 19分别代表2006年收集的不同菌株，11、12是同一医院不同病人收集的标本，
M 是marker2000。

图32007年部分菌株基因分型图
注：1 14分别代表2007年收集的不同菌株，
M 是marker2000。

图42008年部分菌株基因分型图
注：1 14分别代表2008年收集的不同菌株，11、12是同一医院不同病人收集的标本，
M 是marker2000。

图5
2009年部分菌株基因分型图
注：1 17分别代表2009年收集的不同菌株，
M 是marker2000。

图6
2010年部分菌株基因分型图
注：1 24分别代表2010年收集的不同菌株，5、6是同一医院不同病人收集的标本，
M 是marker2000。

菌药物能够有效治疗的新出现的超级病菌”［3］。

嗜麦芽窄食
单胞菌之所以被称为“超级病菌”是因为它不仅导致人类广
泛感染并且对多类化学结构的抗菌药物所具有的高度天然与
获得性耐药给临床治疗带来了严重困难有关
［4-6］。

如果具有固有耐药和临床易感性的嗜麦芽窄食单胞菌在
医院流行传播将是一个严峻的问题，由嗜麦芽窄食单胞菌引
起的医院内爆发流行已见报道［7］，因此对本菌的流行病学调
查至关重要。

本研究应用经典的RAPD-
PCR 方法研究本省188株嗜麦芽窄食单胞菌的亲缘关系，RAPD-PCR 即随机扩
增多态性DNA ，是Williams 和Welsh 等1990年在PCR 的基础上发展起来的一种实验技术，由于它的简便、快速、经济、易于检测等优点RAPD 技术一出现便引起科学工作者的极大兴
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VEGFA基因重组真核表达载体的构建与表达
吴勇1，刘学刚2，郭嘉诚1，李慧敏1，丁周志1，王亚明1，宋伟3，徐家丽1，赵武1
(蚌埠医学院第一附属医院1．儿科;2．心胸外科;3．超声心动图，安徽蚌埠233004)
摘要：目的构建VEGFA基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA，并检测其在人胚胎肾细胞（HEK293T）中的表达。

方法以人脐血单核细胞的RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增VEGFA基因，并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl中，构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA。

经限制性核酸内切酶BglII和SalI酶切和DNA测序鉴定后，用脂质体法将pEGFP-VEGFA转染HEK293T细胞，转染后24h和48h采用荧光显微镜观察pEGFP-VEGFA的表达。

结果pEGFP-VEGFA被双酶切为4697bp 和1251bp两条条带，测序结果证实VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致。

在经转染的HEK293T细胞内观察到较强的绿色荧光，表明pEGFP-VEGFA成功转染HEK293T细胞，并在其中得到了表达。

结论成功构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA，为进一步研究VEGFA基因的生物学功能奠定了基础。

关键词：血管内皮生长因子A；基因；遗传载体
Construction and expression of recombinant eukaryotic
expression vector of VEGFA gene
WU Yong1，LIU Xue-gang2，GUO Jia-cheng1，et al
（Department of1．Pediatrics；2．Cardiothoracic Surgery，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu233004，China）Abstract：Objective To construct a recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-VEGFA，and to detect its expression in HEK293Tcells．Methods VEGFA gene was amplified from the total RNA of human umbilical cord blood monocytes by RT-PCR and then directionally inserted into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1in order to construct the recombinant expression vector pEG-FP-VEGFA．The recombinant vector pEGFP-VEGFA was identified by restriction endonuclease BglII and SalI digestion analysis，and se-quence analysis．The pEGFP-VEGFA was then transfected into the HEK293T cell by lipofectin reagent，and its expression was detected by fluorescence microscopy at24and48h post-transfection．Results The recombinant vector pEGFP-VEGFA was digested into two bands of4697and1251bp．Sequencing results showed that the sequence of VEGFA in pEGFP-VEGFA was identical to GenBank VEG-FA accession number NM_001025366．Strong green fluorescence was observed in the HEK293T cells transfected with the pEGFP-VEG-FA，which showed that the pEGFP-VEGFA had been successfully transfected into the HEK293T cells and acquired expression．Conclu-sion We successfully construct the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-VEGFA，which lays a foundation to further study the biological function of VEGFA gene．
Key words：vascular endothelial growth factor A；gene；genetic vectors
基金项目：安徽省自然科学基金面上项目（No11040606M198）
作者简介：吴勇，男，硕士研究生
通信作者：赵武，男，博士，副教授，研究方向：小儿血管疾病的临床与基础研究，E-mail：zhaowuronghai@yahoo．com．cn
趣，目前这一技术已被广泛用于遗传图谱构建、群体遗传结构分析、DNA指纹分析和基因定位等不同研究领域。

Tatman-Otkun曾用这种方法报道过嗜麦芽窄食单胞菌引起的院内小范围暴发感染，本研究检测到在3家医院的嗜麦芽窄食单胞菌克隆传播流行株，分别是2006年收集同一医院ICU的2株、2008年收集同一医院ICU的2株及2010年收集同一医院新生儿科的2株，2008年ICU的菌株来源于痰标本，其它两个科室的菌株来源于血标本。

我们收集的只是每年9月份的标本，其造成的院内流行爆发情况尚不清楚，如果能应用这种简便、快速的RAPD-PCR方法检测调查院内嗜麦芽窄食单胞菌感染流行情况，就可及时发现临床流行株的爆发，追踪相应的感染源并指导临床加强对病房特殊部位如心电监护仪、微量输液泵、床栏杆、门把手等的清洁和消毒措施。

因此，应用RAPD-PCR方法对临床分离菌株进行基因分型和同源性的快速检测，调查感染流行情况对阻止暴发感染进一步扩大具有重要的临床指导意义。

参考文献：［1］Nazik H， ngen B，Erturan Z，et al．Genotype and antibiotic suscep-tibility patterns of pseudonas aeruginosa and Stenotrophomonas mal-
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veals an organism heavily shielded by drug resistance determinants
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［J］．BMC Microbiology，2008，8：148－162．
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［J］．Int J Antimicrob Agents，2010，35：126－130．
（收稿日期：2012－07－17，修回日期：2012－08－10）
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安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal2013Jan;17(1)。