生物工艺学课件 基因工程菌的稳定性问题

第七章基因工程菌发酵

第二节工程菌的稳定性问题

近年来，重组DNA技术（基因工程）已开始由实验室走向工业生产。

现在，由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等都已先后供应市场，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降，但是从许多研究中发现，工程菌的保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌的稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术的成就转变为生产力的关键之一。

一、工程菌不稳定性的表现（倾向）

工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。具体表现为下列三种形式：质粒的丢失；重组质粒发生DNA片段脱落；表达产物不稳定。

由于某种环境因素或生理、遗传学上的原因，质粒从某些宿主细胞中丢失（消除curing），丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的混合物。在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率（μ+）往往小于不含重组质粒的比生长速率（μ-）。宿主细胞的生长优势对工程菌的发酵极为不利。

有时质粒不稳定并非由于质粒丢失的缘故，而是重组质粒上一部

分片段脱落，表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。

表达产物不稳定也是一个很重要的问题。发现人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。

这种情况在别的工程菌培养过程中也有发现。

二、引起工程菌不稳定性的一些因素及对策

组建成的工程菌的稳定与否，取决于重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等三个方面。

就质粒本身的分子结构而言，引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响。某些质粒如PSC101、R1、F等的分配系统在质粒上的位置已经确定，质粒col DF13有两个DNA序列part A, part B对它的稳定起着不可缺少的作用。枯草杆菌质粒pUB110上几个与膜结合的蛋白基因对稳定性有关。如质粒在重组过程中影响到这些序列的完整性，则其稳定性也受影响，另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等等都会造成质粒的不稳定。

就宿主而言，除了上述质粒中有同源序列外，尚与宿主的比生长

速率、宿主中重组基因（rec系统）的完整性、重组时有关基因的具体变异等都有关系。

在培养环境中高温（如42℃以上）、去垢剂（如SDS等）、某些药物（如利福平、大炭霉素）、染料（如吖啶类、菲啶类）及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等等都会引起质粒的丢失，因而常采取下列措施以防止或降低工程菌的不稳定性。

A 组建合适载体

如PC194是B. subtilis中的一个常用质粒，亦较稳定，但在其Hind III切口处插入一段DNA，形成的重组质粒稳定性就差了。在无选择压力的情况下，经20世代后，含PC194的菌体占总菌体的99.5%以上，而重组质粒则有10%-80%被丢失，这是由于插入外源DNA后破坏了该质粒的稳定区。在离Hind III较远处，即使去换600个碱基，新形成的质粒也与原来的质粒同样稳定。

YR P是能自主复制的酵母质粒，多拷贝但不稳定，即使有选择压力时，也有90%的质粒丢失，而以2μ组成的YE P，由于具有ori附近的稳定区，因而就稳定得多。

以B.licheniformis ATCC 27811为供体，以自组的质粒P NQ122为载体，用Hind III切下的3.9kb片段与之重组获得的PAMY41，但丢失率较高，后来他们将重组质粒用EcoRI切去1.75kb，质粒丢失率由95.4%下降到24%（PAMY411），更换宿主后又降至3.0%，活力也从30倍提高到600倍。

B 选择适当宿主

重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响。相对而言重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。

在选择宿主时，必须确定其遗传特点，这对组建成工程菌之稳定性关系甚大。

Imanaka 等研究了质粒pSC101-trp在E.coli W3110的三种不同突变型中的稳定性。表10-16

J. D. Vehmaanpera 和M. P. Korhola 报导试验pUB110与重组质粒pKTH10在3种不同宿主中对培养50世代后的稳定性作了比较，表-10-17

对正常质粒PUB110而言，在三种宿主中都很稳定，而淀粉酶基因克隆菌PKTH10则有明显差异。

C 施加选择压力

选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。在利用克隆菌进行发酵生产时，经常采取施加选择压力的方法消除重组质粒的分配性不稳定，以提高菌体纯度和发酵生产率。

（1）抗生素添加法通常在重组质粒上含有抗药性基因。在克隆菌发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素，就可阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。

相对于简单培养基而言，加入大量的抗生素会使生产成本增加。对于一些易被酶水解失活的抗生素来说，添加抗生素造成的选择压力只能维持一定的时间，添加抗生素对结构性不稳定无能为力。

（2）抗生素依赖变异法。其方法是通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖性突变株，即只有在该抗生素存在时宿主细胞才能生长，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主细胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长，因此在进行发酵生产时，不需要向培养基中加入抗生素就能起到消除重组质粒分配性不稳定的目的。

（3）营养缺陷型法其原理是通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一原因，而将该基因插入到重组质粒中，然后选择适当组成的培养基使推动重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。例如，将指导合成色氨酸的质粒转入E.coli trp突变株，由于该宿主细胞缺少合成生长所必需的色氨酸的基因，必须在培养基中补加色氨酸后才能存活，因此在利用克隆菌进行发酵时，如果