13 细胞增殖和细胞凋亡检测技术

① 无菌取细胞，培养液调整细胞浓度至 无菌取细胞 培养液调整细胞浓度至1×106/ml / l ② 将细胞悬液加入96孔细胞培养板内，每孔100ul,分对照组和 实验组（实验组加入相应的刺激原，对照组加入等体积的 培养基） 置于细胞培养箱内孵育 培养基），置于细胞培养箱内孵育。 ③ 在终止培养前16‐24小时每孔加入3H-TdR 20ul ④ 将每孔培养物分别吸收于直径24mm的玻璃纤维滤纸上，抽 气过滤并用蒸馏水充分洗涤。 ⑤ 将滤纸片放在烘箱内烘干。 ⑥ 将滤纸片浸于加了10ml脂溶性闪烁液的闪烁杯中，置于液体闪烁计数 中测定每个样品的每分钟脉冲数 液体闪烁计数器中测定每个样品的每分钟脉冲数（cpm值） p 值
6 CCK8检测法 6.
是一种基于 是 种 于WST‐8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速 高灵敏度检测方法。CCK‐8细胞活性检测试剂中含有WST‐8： 2‐(2‐甲氧基‐4‐硝基苯基)‐3‐(4‐硝基苯基)‐5‐(2,4‐二磺酸苯)‐2H‐ 四唑单钠盐]。 WST‐8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情 况下 可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒 况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒 产物formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性 越大，则颜色越浅 对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数 越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数 目呈线性关系。 用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接 反映活细胞数量 该方法已被广泛用于 些生物活性因子的 反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的 活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞 毒性试验以及药敏试验等。 毒性试验以及药敏试验等
Hoechst是与DNA特异结合的活性 染料，储存液用蒸馏水配成 1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释 成终浓度为2~5mg/ml g/ 。 DAPI为半通透性，用于常规固定细 胞的染色。储存液用蒸馏水配成 1mg/ml g 的浓度，使用终浓度一般 为0.5 ~1mg/ml。
（三）透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小 表面微绒 凋亡细胞体积变小，表面微绒 毛消失，细胞质浓缩。 凋亡Ⅰ期（pro‐apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高 度盘绕，出现许多称为气穴现 象（cavitations it ti ）的空泡结 构，；Ⅱa期细胞核的染色质 高度凝聚 边缘化；细胞凋亡 高度凝聚、边缘化；细胞凋亡 的晚期，细胞核裂解为碎块， 产生凋亡小体。
3H TdR掺入法：结果判定 3H-TdR掺入法：结果判定
以液体闪烁计数器测定每分的脉冲数cpm。取各管测定读数 的平均值，即为0.1ml细胞的脉冲数。再按淋巴细胞计数结果， 校正成每百万淋巴细胞的脉冲数（cpm/106淋巴细胞）。 也可以刺激指数（SI）表示试验结果，试验管脉冲数与对照 管脉冲数之比，即为刺激指数。
Giemsa staining 姬 姆萨染液 （天青色素、伊红、 青色素 伊 次甲蓝的混合液） 瑞氏 Wright ' s stain （美蓝－伊红）
（二）荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI。 三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A‐T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的 细胞核呈波纹状（rippled i l d）或呈折缝样（creased d），部分染 ） 部分染 色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化； Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
操作繁琐 测定波长：490～550nm 量比较大
为1瓶溶液，无需预制，即开 由于需要加有机溶剂溶解，工作
7 Ki67染色法 7.
增殖细胞核抗原(Ki‐67)是1983年由Gerdes等发现在增殖细胞 中表达的一种核抗原，是目前较为肯定的核增殖标志物， 只在增殖期表达 只在增 期表 ( (G1，S和G2/ /M期)，Go期缺如 期缺如。与细胞有丝 与 胞有 分裂密切相关，预示将进入分裂期的细胞数目。它在细胞 有丝分裂过程中维持DNA结构的稳定性，在多种恶性肿瘤中 过表达 其表达水平 用于 价细胞的增殖状态 肿瘤的 过表达，其表达水平可用于评价细胞的增殖状态、肿瘤的 生物学行为。 Ki‐67只与增殖细胞核反应，而无组织特异性，其表达增强 是细胞有 分裂 增殖活性增强的 个可靠标记 研究表 是细胞有丝分裂、增殖活性增强的一个可靠标记，研究表 明Ki‐67的表达能可靠而迅速地反映恶性肿瘤增殖率。
BrdU 与EdU 检测原理示意图
BrdU 与EdU 检测优缺点比较
4 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 4. (CFSE)检测法
羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细 胞膜的荧光染料 具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团 胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团 和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成 为 种良好的细胞标记物。 为一种良好的细胞标记物 CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细 细胞后 以不 与细胞内的氨 结 偶联到细 胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个 子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一 个增殖的细胞群中 各连续代细胞的荧光强度呈对递减 利用 个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用 流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
直接计数 胸腺嘧啶核苷(3HLeabharlann BaiduTdR) )渗入法 MTT检测法 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 (CFSE)检测法 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法 CCK8 Ki67
1.直接计数 直接计数
利用计数板或计数仪得出细胞的数目 然后对数目进行比较 利用计数板或计数仪得出细胞的数目，然后对数目进行比较。 优点： 简单：不需要特定的试剂和仪器 准确 缺点： 不适合样品数量多的情况 不适合评估特定的亚群
3. 细胞调亡--DNA的片段化
凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA 片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确 定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
试验孔A SI 对照孔A
570nm
均值 值 570nm 均
优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。 缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。 缺点 但需 定设备条件 同时还存在放射性核素污染问题
3. 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法 5 溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法
5. MTT检测法
MTT检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一 种简便准确的方法。其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线 粒体内的脱氢酶可将黄色的 MTT分解成兰紫色的水不溶性的甲 分解成兰紫色的水不溶性的 瓒(Formazan)，并沉积在细胞中，死细胞无此功能。二甲基亚 砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒 用酶联免疫检测仪在490nm波 砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波 长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数 范围内 范围内，MTT结晶形成的量与细胞数和细胞活力成正比。该方法 结晶形成的量与细胞数和细胞活力成 该方法 已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药 物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
细胞 细胞凋亡检测技术 检 技术
1. 2 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
形态学检测 Annexin V DNA Fagmentation TUNEL 线 线粒体膜电位 细胞色素c释放 C Caspase活性 活性 凋亡相关蛋白检测
1. 形态学检测
（一）光学显微镜和倒置显微镜 1、未染色细胞 凋亡细胞的体积变小 变形 细胞膜完整但出现发泡现象 细胞 凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞 凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 2、染色细胞 常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化， 核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
Lecture-13
细胞生物学实验方法与原理
第十三讲 细胞增殖和细胞凋亡 检测技术
江维
12‐13‐2012
Contact Email：ustcjw@ustc.edu.cn School of Life Sciences, Sciences USTC
细胞增殖检测技术
1. 2. 3. 4. 5. 6 6. 7.
2.胸腺嘧啶核苷( 2 胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法 H TdR)渗入法
胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基 也是DNA合成的必需 胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需 物质。用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入 DNA合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细 胞DNA的代谢及细胞增殖情况。
CCK‐8法或称WST‐8法 1 （不需要溶解） 2 重现性好
MTT法 （需要加有机溶剂溶解） 由于在去上清操作时会有可能带 走小部分的Formazan，故有时重 复性略差
还原后的Formazan是水溶性的 还原后的Formazan是非水溶性的
3 4 5
操作简便 测定波长：450～490nm 即用
Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S 是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在 合成期（S 期），活体注射或细胞培养加入，而后利用Brdu专一性抗体， 显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断 增殖细胞的种类 增殖速度 对 究细胞动力学有重要意义 增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。 BrdU有一大缺点，就是需要变 性DNA后才能与抗体结合，但这 就破坏了 就破坏了DNA双链结构，影响了 双链结构 影响了 其他染料的结合染色，导致染 色弥散 准确性降低等问题 色弥散，准确性降低等问题。 优点：不仅能用于体外实验，还 能用于活体实验
EdU （5 （5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷） 乙炔基 2 脱氧尿嘧啶核苷）也是 也是一种胸腺嘧啶核 种胸腺嘧啶核 苷类似物。它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入 正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性 反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞 检 检 标 的增殖情况。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500 ，在细 胞内很容易扩散 无需DNA变性（酸解 热解 酶解等）即可 胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可 有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确 地反映细胞增殖等现象。
2 Annexin V/PI 染色 2.
凋亡细胞的细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从 细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。 Annexin i V是一种 是 种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种 依赖的磷脂结合蛋白 最初发现是 种 具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结 合到磷脂类如PS的特性。对 的特性 对PS有高度的亲和性。因此，该蛋 有高度的亲和性 因此，该蛋 白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。 荧光染料PI（Propidium Iodide，碘化丙啶）是一种可对DNA 染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。它是一种溴 化乙啶的类似物 在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管 化乙啶的类似物，在嵌入双链 后释放红色荧光 尽管PI 不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。