酪氨酸酶抑制及激活作用动力学的分析共15页文档
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以底物浓度（mol/L）倒 数1/[S]对酶催化活性 OD/min值的倒数1/V作图， 根据三条线的交点判断抑制剂 的类型。
2020/6/3
三、实验报告
采用四人一组，每两人选择两个化合物进行测 1 试。因为每个实验由10个点构成，可以去掉几
个点得到比较理想的曲线。
两名百度文库生只对自己所做的实验过程和结果进行 2 分析，按照研究论文形式写出实验报告。
❖ 酪氨酸酶的底物结合部位，由于铜原子与氧的结合部位关 系密切，故凡能与铜原子形成复合物的化学试剂均有可能 是酶的有效抑制剂。苯甲酸、叠氮化物、氰化物、苯硫脲 和半胱氨酸等对O2与酶结合有竞争作用；非酚类芳香族 化合物对底物与酶结合有竞争作用。近些年来，人们从植 物中分离出多种酪氨酸酶抑制剂用于化妆品工业，如熊果 苷、曲酸、根皮素等。
2020/6/3
二、实验过程
酶抑制剂的高通量筛选可以 通过酶标仪进行，但系统地 、准确地研究抑制剂的IC50 以及抑制作用的动力学必须 通过精密仪器进行检测。 本实验将利用紫外-可见分 光光度计测试几种化合物对 马铃薯多酚氧化酶（酪氨酸 酶）的抑制和激活作用的动 力学。
2020/6/3
实验材料： 马铃薯酪氨酸酶粗酶 （前面实验提取） 抑制剂：硫酸亚铁、 六羟基二苯甲酮、2萘酚 激活剂：1-萘酚、硫 酸铜、二羟基二苯甲 酮
实验安排
3，抑制剂IC50的测试 改变样品溶液的剂量，分别
测试酶催化活性。可以通过稀 释的方式改变样品的浓度。
以没有加入样品的酶催化活 性OD/min值为100%，用抑 制百分数(指被抑制而失去活 力的百分数)表示不同浓度样 品对酶的抑制活性，作图求出 抑制50%时样品的浓度。
2020/6/3
实验安排
一、实验基本原理
酪氨酸酶(Tyraseosinase ，Tyrase)又称儿茶酚氧 化酶(Ec.1.14.18.1)属于 多酚氧化酶（漆酶和二酚 氧化酶）中的一种。它广 泛存在于红薯、香蕉、苹 果、蘑菇、马铃薯及人体 等动植物中，也存在于微 生物，特别是霉菌之中。
2020/6/3
在动植物体内，酪氨酸酶 对酪氨酸和其它酚类化合 物的代谢以及黑色素的合 成起重要的催化作用。酪 氨酸酶可以催化两类不同 的反应：单酚羟基化形成 邻二酚和邻苯二酚氧化成 邻醌，这两类反应都必须 有氧分子的直接参与。
4，抑制剂动力学的测试 适当选择2个不同的样品浓
度，以及没加样品三个系列， 改变底物溶液的剂量，分别测 试酶催化活性。
以底物浓度（mol/L）倒 数1/[S]对酶催化活性 OD/min值的倒数1/V作图， 根据三条线的交点判断抑制剂 的类型。
2020/6/3
实验安排
5，激活作用的测试 改变样品溶液的剂量，分别
黑色素形成机制
❖ 对黑色素细胞内的黑色素形成机理的研究表明，黑色素的 形成主要是由黑色素细胞内的四种酶：酪氨酸酶､多巴异 构酶、过氧化物酶、等酶单独或协同作用的结果。
❖ 大量的研究表明，黑素细胞内黑色素的生物合成是一个由 酪氨酸酶催化体内酪氨酸羟化而启动的一系列生化反应： 体内酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成 3,4-二羟基苯丙氨酸 即多巴，多巴进一步氧化生成多巴醌，多巴醌经多聚化反 应与氧化反应生成多巴色素，在多巴色素异构酶 作用下, 多巴色素羟化为5,6-二羟基吲哚羧酸, 脱羧成 5,6-二羟基 吲哚, 再在酪氨酸酶催化下氧化成 5,6-吲哚醌, 最后与其 它中间产物结合形成真黑色素。脱黑色素的形成其前部分 -由酪氨酸到多巴醌与真黑色素一致, 但在以后的反应中有 半胱氨酸参加, 产生Cys-多巴和 Cys-多巴醌, 通过关环､ 脱羧, 最后形成脱黑色素。
2020/6/3
2020/6/3
❖ 酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的关键酶，它不仅决定黑素 合成的速率,还是黑素细胞分化成熟的特征性标志，因此 它给人体皮肤美白带来困难。酪氨酸酶的活性与黑素合成 量相关，控制其活力即可控制黑素生成量。因此，研究酪 氨酸酶的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化妆品中的皮 肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病（黄 褐斑、黑色素瘤等色素沉着性皮肤病等），具有非常重要 的治疗意义。
实验仪器和条件
北京普析通用UV-1901 紫 外可见分光光度计
2020/6/3
实验条件： 缓冲液：0.1mol/LpH 6.8磷酸盐缓冲液。 底物：25mol/L 邻苯二 酚 化合物溶液的配制： 1-萘酚和二羟基二苯甲酮 用乙醇配成50mol/L。 2-萘酚和六羟基二苯甲酮 用乙醇配成10mol/L。 硫酸亚铁和硫酸铜用蒸馏 水配成50mol/L。
实验安排
1，酶催化条件探索 由于每次实验得到的粗酶
液酶催化活性不同，所以在 测试过程中，需要探索实验 中所使用的酶的剂量。
本实验要求测试的酶催化 活性-每分钟OD值变化在 0.1-0.13范围内。本实验采 用调节酶液用量的方式。
2020/6/3
2，测试体系 在总计1000L的测试体 系中，加入920或930L 0.1mol/LpH 6.8磷酸盐 缓冲液，10L样品溶液（ 以10 L缓冲液或乙醇做 对照），10-20L粗酶液 ，室温放置20分钟，立即 加入50L 25mol/L 邻苯 二酚溶液， 390nm进行 时间扫描，记录1分钟的 OD值。
实验中尽可能了解其他同学的实验过程和实
3
验结果，如果可能结合起来一起进行分析。
2020/6/3
四、实验注意事项
1. 实验中，需要细心，要正确使用移液器 2. 一次性比色皿有方向性，使用时要注意 3. 实验结果分析、讨论须有自己的论点
2020/6/3
谢谢！
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测试酶催化活性。可以通过稀 释的方式改变样品的浓度。
以没有加入样品的酶催化活 性OD/min值为100%，用激 活百分数(指被激活而增加活 力的百分数)表示不同浓度样 品对酶的激活活性，作图求出 最大激活活性时样品的浓度。
2020/6/3
实验安排
6，激活剂动力学的测试 适当选择2个不同的样品浓
度，以及没加样品三个系列， 改变底物溶液的剂量，分别测 试酶催化活性。
2020/6/3
三、实验报告
采用四人一组，每两人选择两个化合物进行测 1 试。因为每个实验由10个点构成，可以去掉几
个点得到比较理想的曲线。
两名百度文库生只对自己所做的实验过程和结果进行 2 分析，按照研究论文形式写出实验报告。
❖ 酪氨酸酶的底物结合部位，由于铜原子与氧的结合部位关 系密切，故凡能与铜原子形成复合物的化学试剂均有可能 是酶的有效抑制剂。苯甲酸、叠氮化物、氰化物、苯硫脲 和半胱氨酸等对O2与酶结合有竞争作用；非酚类芳香族 化合物对底物与酶结合有竞争作用。近些年来，人们从植 物中分离出多种酪氨酸酶抑制剂用于化妆品工业，如熊果 苷、曲酸、根皮素等。
2020/6/3
二、实验过程
酶抑制剂的高通量筛选可以 通过酶标仪进行，但系统地 、准确地研究抑制剂的IC50 以及抑制作用的动力学必须 通过精密仪器进行检测。 本实验将利用紫外-可见分 光光度计测试几种化合物对 马铃薯多酚氧化酶（酪氨酸 酶）的抑制和激活作用的动 力学。
2020/6/3
实验材料： 马铃薯酪氨酸酶粗酶 （前面实验提取） 抑制剂：硫酸亚铁、 六羟基二苯甲酮、2萘酚 激活剂：1-萘酚、硫 酸铜、二羟基二苯甲 酮
实验安排
3，抑制剂IC50的测试 改变样品溶液的剂量，分别
测试酶催化活性。可以通过稀 释的方式改变样品的浓度。
以没有加入样品的酶催化活 性OD/min值为100%，用抑 制百分数(指被抑制而失去活 力的百分数)表示不同浓度样 品对酶的抑制活性，作图求出 抑制50%时样品的浓度。
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实验安排
一、实验基本原理
酪氨酸酶(Tyraseosinase ，Tyrase)又称儿茶酚氧 化酶(Ec.1.14.18.1)属于 多酚氧化酶（漆酶和二酚 氧化酶）中的一种。它广 泛存在于红薯、香蕉、苹 果、蘑菇、马铃薯及人体 等动植物中，也存在于微 生物，特别是霉菌之中。
2020/6/3
在动植物体内，酪氨酸酶 对酪氨酸和其它酚类化合 物的代谢以及黑色素的合 成起重要的催化作用。酪 氨酸酶可以催化两类不同 的反应：单酚羟基化形成 邻二酚和邻苯二酚氧化成 邻醌，这两类反应都必须 有氧分子的直接参与。
4，抑制剂动力学的测试 适当选择2个不同的样品浓
度，以及没加样品三个系列， 改变底物溶液的剂量，分别测 试酶催化活性。
以底物浓度（mol/L）倒 数1/[S]对酶催化活性 OD/min值的倒数1/V作图， 根据三条线的交点判断抑制剂 的类型。
2020/6/3
实验安排
5，激活作用的测试 改变样品溶液的剂量，分别
黑色素形成机制
❖ 对黑色素细胞内的黑色素形成机理的研究表明，黑色素的 形成主要是由黑色素细胞内的四种酶：酪氨酸酶､多巴异 构酶、过氧化物酶、等酶单独或协同作用的结果。
❖ 大量的研究表明，黑素细胞内黑色素的生物合成是一个由 酪氨酸酶催化体内酪氨酸羟化而启动的一系列生化反应： 体内酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成 3,4-二羟基苯丙氨酸 即多巴，多巴进一步氧化生成多巴醌，多巴醌经多聚化反 应与氧化反应生成多巴色素，在多巴色素异构酶 作用下, 多巴色素羟化为5,6-二羟基吲哚羧酸, 脱羧成 5,6-二羟基 吲哚, 再在酪氨酸酶催化下氧化成 5,6-吲哚醌, 最后与其 它中间产物结合形成真黑色素。脱黑色素的形成其前部分 -由酪氨酸到多巴醌与真黑色素一致, 但在以后的反应中有 半胱氨酸参加, 产生Cys-多巴和 Cys-多巴醌, 通过关环､ 脱羧, 最后形成脱黑色素。
2020/6/3
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❖ 酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的关键酶，它不仅决定黑素 合成的速率,还是黑素细胞分化成熟的特征性标志，因此 它给人体皮肤美白带来困难。酪氨酸酶的活性与黑素合成 量相关，控制其活力即可控制黑素生成量。因此，研究酪 氨酸酶的抑制，对防止水果、蔬菜的褐变，化妆品中的皮 肤增白，以及因酪氨酸酶催化产生黑色素引起的疾病（黄 褐斑、黑色素瘤等色素沉着性皮肤病等），具有非常重要 的治疗意义。
实验仪器和条件
北京普析通用UV-1901 紫 外可见分光光度计
2020/6/3
实验条件： 缓冲液：0.1mol/LpH 6.8磷酸盐缓冲液。 底物：25mol/L 邻苯二 酚 化合物溶液的配制： 1-萘酚和二羟基二苯甲酮 用乙醇配成50mol/L。 2-萘酚和六羟基二苯甲酮 用乙醇配成10mol/L。 硫酸亚铁和硫酸铜用蒸馏 水配成50mol/L。
实验安排
1，酶催化条件探索 由于每次实验得到的粗酶
液酶催化活性不同，所以在 测试过程中，需要探索实验 中所使用的酶的剂量。
本实验要求测试的酶催化 活性-每分钟OD值变化在 0.1-0.13范围内。本实验采 用调节酶液用量的方式。
2020/6/3
2，测试体系 在总计1000L的测试体 系中，加入920或930L 0.1mol/LpH 6.8磷酸盐 缓冲液，10L样品溶液（ 以10 L缓冲液或乙醇做 对照），10-20L粗酶液 ，室温放置20分钟，立即 加入50L 25mol/L 邻苯 二酚溶液， 390nm进行 时间扫描，记录1分钟的 OD值。
实验中尽可能了解其他同学的实验过程和实
3
验结果，如果可能结合起来一起进行分析。
2020/6/3
四、实验注意事项
1. 实验中，需要细心，要正确使用移液器 2. 一次性比色皿有方向性，使用时要注意 3. 实验结果分析、讨论须有自己的论点
2020/6/3
谢谢！
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测试酶催化活性。可以通过稀 释的方式改变样品的浓度。
以没有加入样品的酶催化活 性OD/min值为100%，用激 活百分数(指被激活而增加活 力的百分数)表示不同浓度样 品对酶的激活活性，作图求出 最大激活活性时样品的浓度。
2020/6/3
实验安排
6，激活剂动力学的测试 适当选择2个不同的样品浓
度，以及没加样品三个系列， 改变底物溶液的剂量，分别测 试酶催化活性。