醋酸菌菌种分离筛选方法

醋酸菌菌种分离筛选方法

醋酸菌的细胞为椭圆至杆状，单个成双或成链，鞭毛周生或端生，运动或不运动，革兰氏阴性菌，好氧菌，一般在乙醇或其他可氧化物的酵母煮液或酵母消化液培养基生长旺盛。

醋酸的钠盐和钙盐与三氯化铁共热，生成红褐色沉淀，原液变成无色。可进行分离菌鉴别。

1.培养基：

1.1米曲汁乙醇碳酸钙培养基：米曲汁（10-12BX）1000ml CaCO310-15g 95℅乙醇30-40ml（灭菌后加入） PH自然

1.2葡萄糖碳酸钙培养基：葡萄糖15g/L 酵母膏10g/L CaCO3 15g/L PH 6.8

1.3乙醇30mL/L 酵母膏10g/L葡萄糖10g/L CaCO3 10-15g/L

（常规筛选培养基） PH 6.8-7.0

注：常规培养基中的碳酸钙易沉淀，平板不易观察到透明圈，选择米曲汁乙醇碳酸钙培养基为好。

1.4醋酸菌保存培养基：酵母膏15g/L葡萄糖10g/L CaCO3 15-20g/L 琼脂15-20 g/L 3-4滴乙醇/试管。

1.5液体种子和发酵培养基：乙醇30-35mL/L 膏酵母10g/葡萄糖10g/L KH2PO40.5g/L MgSO40.5g/L PH 6.5-6.8

2.菌种筛选：

2.1集菌：1-2g（5ml）样品，在无菌下加入30-50ml/250ml米曲汁乙醇液体培养基（0.5ml 0.02℅结晶紫醋酸溶液/100ml培养液）中，

30-33℃震荡培养24-48h，集菌液PH明显下降，有醋味，镜检细胞革兰氏染色阴性。形态与醋酸菌相符即可分离。

2.2混菌法分离：（分离及初筛）

适度稀释10-5、10-6、10-7 取1.0ml菌液置于无菌平板或涂布中，每个梯度平行两次，米曲汁乙醇碳酸钙培养基倒平板，30℃ 24-48h，观察有小菌落出现，菌落周围形成透明圈，圈的大小因菌而异。挑透明圈出现早且菌落丰厚，边缘整齐，生长旺盛不同的菌落转接于曲汁乙醇碳酸钙斜面，30-33℃ 24-48h。根据菌落周围溶解透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。

2.3性能测定：（复筛）

不同菌落接种于液体曲汁乙醇培养基（30-50ml/250ml）中，30℃震荡培养24-48h。2.3.1镜检：染色镜检细胞整齐，椭圆或短杆状，革兰氏阴性菌。

2.3.2性能测定：

醋酸定性分析：取发酵液（离心去菌体）5.0ml于洁净试管中，用10℅氢氧化钠中和PH至7.0，加入1℅三氯化铁溶液2-3滴，摇匀，观察溶液是否变黄褐色，加热共沸，形成红褐色沉淀，原液变无色者为产醋酸细菌。

生酸量测定：1.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。

醋酸量（g/100mL）= 氢氧化钠摩尔浓度.Vx60.06x10-3 /样品毫升数x100

同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。