白斑综合症病毒极早期蛋白WSV403相互作用蛋白的筛选

ｍｉｎ。将 ＰＥＩ溶液加入 ＤＮＡ溶液中，涡旋混合，将混 合物在室温下孵育 ２０ｍｉｎ，随后滴加到细胞培养液 中，６ｈ后换新的培养基培养。 １．３ 慢病毒的包装和稳定细胞系的产生 １．３．１ ＷＳＶ４０３慢病毒表达质粒的构建 本研究利 用不依赖于连接酶的克隆方法（ＬｉｇａｔｉｏｎＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＬＩＣ）进 行 基 因 克 隆［１８］。 以 实 验 室 保 存 的 含有 ＷＳＶ４０３基因的质粒为模板，用 ＷＳＶ４０３ＬＩＣＦ 以及 ＷＳＶ４０３ＬＩＣＲ引物（表 １）进行 ＰＣＲ扩增，在 其两端引 入 与 载 体 插 入 位 点 两 端 同 源 的 序 列；将 ｐＬＬＳｔｒｅｐＦＬＡＧ用 ＢａｍＨＩ和 ＸｈｏＩ酶切。用琼脂糖 凝胶电泳检测并纯化回收目的条带与酶切载体之 后，利用核酸外切酶 ＩＩＩ将 ＷＳＶ４０３基因连接到 ｐＬＬ ＳｔｒｅｐＦＬＡＧ 载 体 上［１９］，获 得 ｐＬＬＳｔｒｅｐＦＬＡＧ ＷＳＶ４０３。其中 ＷＳＶ４０３与 Ｓｔｒｅｐ以及 ＦＬＡＧ标签融 合表达。
３８卷
Ｆｌｕｏｒ４８８抗体、山羊抗兔偶联 ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６抗体， 购自 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司。 １．１．２ 质 粒 慢 病 毒 包 装 质 粒 ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、 ｐＶＳＶＧ、ｐＲＳＶＲＥＶ由 厦 门 大 学 韩 家 淮 教 授 赠 予。 载体 ｐＬＬＳｔｒｅｐＦＬＡＧ和 ｐＣＭＶＨＡ由自然资源部第 三海洋研究所李增鹏博士提供。载体 ｐｃＤＮＡ３．１ ＷＳＶ４０３ＦＬＡＧ和 ｐｃＤＮＡ３．１ＷＳＶ４０３Ｈ３４８ＴＦＬＡＧ由 本实验室保存。 １．２细胞的培养和转染
收稿日期：２０１８０６１９ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（４１２７６１７６） 作者简介：马艳丽（１９９２—），女，硕士研究生；Ｅｍａｉｌ：２５５０７８０７７２＠ｑｑ．ｃｏｍ 通讯作者：李钫（１９７７—），女，研究员；Ｅｍａｉｌ：ｌｉｆａｎｇ＠ｔｉｏ．ｏｒｇ．ｃｎ
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应用海洋学学报
第 ３８卷 第 ３期 ２０１９年 ８月
应用海洋学学报
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄ Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ
Ｖｏｌ３８，Ｎｏ３ Ａｕｇ，２０１９
白斑综合症病毒极早期蛋白 ＷＳＶ４０３相互 作用蛋白的筛选
马艳丽，李 钫，杨 丰
（自然资源部第三海洋研究所、海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门 ３６１００５）
人胚肾细胞 ２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ，美国种质保藏中 心）培养在体积分数为 １０％ 的胎牛血清的 ＤＭＥＭ 高糖培养基中，培养条件为 ３７°Ｃ，５％ＣＯ２。转染前 １２ｈ，将细胞（约 ４×１０６ｃｅｌｌｓ）接种在 １０ｃｍ培养皿 中，用聚乙烯亚胺（ＰＥＩ）进行转染。将 １０μｇ质粒 ＤＮＡ和 ３０ｍｍ３浓度为 ５０μｍｏｌ／ｄｍ３ＰＥＩ溶液分别用 ０．５ｃｍ３ ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ公司）稀释，室温放置 １０
摘要：ＷＳＶ４０３是白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）的一个极早期基因，它编码一种 Ｅ３泛素连接酶。在 ２９３Ｔ
细胞中，利用串联亲和纯化和蛋白质谱技术筛选 ＷＳＶ４０３的相互作用蛋白，获得了 １５个可能与
ＷＳＶ４０３结合的蛋白。在此基础上对 ５个候选基因进行了克隆，并分别将它们与 ＷＳＶ４０３基因共表
达。通过免疫共沉淀和免疫荧光分析证实了 ＷＳＳＶ极早期蛋白 ＷＳＶ４０３能够与核转运蛋白（ＫＰ
了解病毒的感染机制是建立有效防治方法的基 础。ＤＮＡ病毒的极早期（ＩｍｍｅｄｉａｔｅＥａｒｌｙ）基因是控 制感染的起始以及从潜伏期转换到增殖期的一类重 要基因，这类基因可以借助宿主转录因子和 ＲＮＡ聚 合酶 ＩＩ进行转录，无需利用新合成的病毒蛋白［７］。 其编码的极早期蛋白能够通过错综复杂的策略调控 宿主的生理与免疫状态，营造有利于病毒复制的环 境［８９］。因此，针对病毒极早期蛋白功能的研 究 对 认识病毒感染的核心机制是十分重要的。根据病毒 的转录时相特征，ＷＳＳＶ基因可以分为极早期、早期 和晚期基因 ３种基因类型［１０］。到目前为止，研究人 员利 用 基 因 芯 片 以 及 ＲＴＰＣＲ等 实 验 方 法，已 从 ＷＳＳＶ中鉴定出 ２１个极早期基因［１１１３］。
其中极早期基因 ＷＳＶ４０３编码的蛋白是一个包 含 ＲｉｎｇＨ２结构域的 Ｅ３泛素连接酶 。 ［１４］ 该蛋白在 Ｅ１泛素激活酶和 Ｅ２泛素结合酶存在的情况下，能 被聚泛素化［１５］。此外，研究者发现 ＷＳＶ４０３基因能 够在无特异致病原的虾中转录［１６］，它还能与另一个 潜伏相关蛋白 ＷＳＶ４２７的互作因子蛋白磷酸酶结 合［１６１７］，提示了 ＷＳＶ４０３与 ＷＳＳＶ的潜伏之间存在 联系［１３］。但是，ＷＳＶ４０３如何在 ＷＳＳＶ的感染过程 中发挥作用仍然属未知。
中图分类号：Ｐ７３５
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文献标识码：Ａ
文章编号：２０９５４９７２（２０１９）０３０３７３０８
白斑综合症病毒（ＷＳＳＶ）是 ＤＮＡ病毒，呈双链 环状，在分类上属于线性病毒科，白斑病毒属（Ｗｈｉｓ ｐｏｖｉｒｕｓ）［１］，是导致对虾白斑综合症的元凶。该病毒 具有发病快、传播范围广、致死率高的特征，长期困 扰着全球的对虾养殖业 。 ［２６］ 目前，虽然可以 通 过 健康的养殖模式与密切的病原监测来预防 ＷＳＳＶ的 感染，但是该病毒一旦在养殖池暴发我们仍然是无 计可施。
ＮＡ６）、丝 ／苏氨酸蛋白磷酸酶 ２Ａ６５ｋＤａ调节亚基 Ａ（ＰＰＰ２ＲＩＡ）和 ｓｔｒｉａｔｉｎ（ＳＴＲＮ）发生相互作用。
该研究结果为进一步揭示 ＷＳＶ４０３的作用机制奠定了基础。
关键词：海洋生物学；白斑综合症病毒；ＷＳＶ４０３；免疫共沉淀；相互作用
ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．２０９５４９７２．２０１９．０３．００９
为进一步了解 ＷＳＶ４０３的作用机制，本研究中 我们以 ２９３Ｔ细胞为表达系统，利用串联亲和纯化技 术和蛋白质谱技术筛选 ＷＳＶ４０３的相互作用蛋白， 进一步对部分基因进行了克隆表达，并通过免疫共 沉淀和免疫荧光分析验证它们之间的相互作用。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料 １．１．１ 抗体 一抗：鼠抗 ＦＬＡＧ单克隆抗体、兔抗 ＨＡ单克 隆 抗 体，购 自 Ｓｉｇｍａ公 司；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ二 抗：山羊抗小鼠偶联 ＡＰ抗体、驴抗兔偶联 ＡＰ抗体， 购自 Ｓｉｇｍａ公司；免疫荧光二抗：驴抗鼠偶联 Ａｌｅｘａ