一代测序与二代测序的区别与联系

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一代二代三代测序原理

一代测序原理：

一代测序技术也被称为Sanger测序技术，是人类基因组序列测定的

里程碑。这种测序技术通过DNA链延伸反应（dideoxy chain

termination reaction）定序。该技术基于以下原理：

1.DNA合成时，短链上的dNTPs（脱氧核苷三磷酸盐）与DNA聚合酶

结合，并添加到扩增链的3'末端。

2.在DNA链延伸反应中，四种不同的dNTPs被添加到反应体系中。

3. 此反应体系中含有小量的标记性的dNTPs，如荧光标记的ddNTPs （二碱基脱氧核苷酸盐）。这些标记性ddNTPs会引发链终止，因此DNA

的合成会停止在特定的位置。

4.在终止合成后，反应体系中所有DNA分子被分离出来，并通过高效

液相色谱法（HPLC）或凝胶电泳法进行分离。

5. 分离后，根据不同的ddNTP标记，可以知道DNA每个位置上的碱

基是什么。

二代测序原理：

二代测序技术是一种高通量测序方法，包括Illumina的Solexa测序、Roche的454测序和Ion Torrent的Ion Proton等。这些技术基于以下

原理：

1.首先，DNA样本必须被剪成短片段，并与适配器序列连接。适配器

序列可以在扩增中参与引物的结合。

2.在PCR扩增过程中，适配器序列连接的DNA片段会大量复制形成聚集，形成簇。

3.簇内的DNA片段会结合荧光标记为碱基。

4.然后，DNA链会被分离，暴露于荧光标记的碱基。

5. 再次用过量的单核苷酸引发链延伸反应，反应中使用荧光标记的ddNTPs（二碱基脱氧核苷酸盐）。

一二三四代测序技术原理详解

一、第一代测序技术原理

第一代测序技术最早出现于1977年，是由Sanger等人发明的，并被

称为“链终止法”。其原理是通过DNA聚合酶将输入的DNA序列再生产出

一条互补链，同时在每个位点上加入一种特殊的荧光标记的二进制核苷酸，然后将这些被标记的DNA片段分开进行电泳，根据电泳结果可以得到DNA

的序列。

第一代测序技术的核心原理是首先将待测序列分成多个片段，然后利

用DNA聚合酶在每个片段的3'末端加入一种荧光标记的二进制核苷酸。

这种核苷酸的特殊之处在于，它们只能和待测序列的碱基互补配对，并且

在加入过程中会停止DNA链的生长。随后，将加入了荧光标记的DNA片段

进行分离和电泳。由于不同长度的DNA片段在电场下移动的速度不同，所

以通过观察不同片段的移动位置，可以推断出每个片段的碱基序列。

二、第二代测序技术原理

第二代测序技术的原理是通过对待测DNA片段进行多轮的扩增和测序，最后将所有结果进行比对和组装，得到完整的DNA序列。

第二代测序技术的核心原理是将待测DNA样本分成许多小片段，然后

将每个片段进行扩增，所得到的扩增产物再次进行扩增，并且在扩增过程

中引入一种荧光标记的二进制核苷酸。在每个扩增步骤之后，需要将扩增

产物进行分离，例如利用固相法将扩增产物固定在芯片上。然后，对每个

扩增产物进行毛细管电泳或基于光信号的测量，以确定每个扩增产物对应

的碱基序列。最后，通过将所有碱基序列进行比对和组装，可以得到待测DNA的完整序列。

第二代测序技术相较于第一代测序技术具有更高的通量和更低的成本，可以同时进行大规模的测序，因此被广泛应用于基因组学和生物医学研究。

一代,二代,三代测序原理

➢ 三代测序读长长，遇到大基因组测序，在极短时间内完可成拼接。
优势2 ：无GC偏好性
➢ 测序不受GC含量的影响，因为构建文库过程无需PCR反应，PCR反应GC含量高的片段比GC含量低的片段扩增慢，所以二代测序GC含量高的片段出现概率要低。
三代测序
优势3 ：高准确率
SMRT 测序优势
。
三代测序
一个A碱基
2.RT-PCR
二代测序
文库的构建
Rd1 SP：第一条链测序引物；
I7：
第一条测序完，用I7引物测序第一条链上的index 1序列；
P5：
再用P5为引物测序第一条链上的index 2；
Rd1 SP：第二条链测序引物；
➢ 因不同的样品可以同时在一个流动槽里进行测序反应，index 1和index 2 序列可以通过加或者不加来区分不同的样本来源；
一代测序
一代测序一般指Sanger测序，是上世纪70年代由sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，当初几十个国家花了几十亿刀完成的人类基因组计划就是使用的改良版sanger测序。
Sanger测序一次可以读取600-1000bp的碱基，准确性十分之高，至今仍是正确性的金标准。该技术在当下依然被广泛应用，比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到。但其通量实在太低，导致在很多情况下成本太高，难以广泛应用。

一代、二代、三代测序技术

(2014-01-22 10:42:13)

转载

第一代测序技术-Sanger链终止法

一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。

第二代测序技术-大规模平行测序

大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。（3）测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开

DNA测序技术发展史一代二代三代测序技术简要原理及比较

DNA测序技术发展史一代二代三代测序技术简要原理及

比较

一、一代测序技术

一代测序技术最早出现于1977年，由Sanger和Gilbert等人开发。

其原理基于DNA链延伸，即通过将DNA链合成过程中加入少量的dideoxy

核苷酸（ddNTP），使得DNA链延伸在一些特定位置停止，并通过凝胶电

泳分析停止位置来确定每个核苷酸的顺序。

一代测序技术的特点是：

1.准确性较高，可以达到99.99%的准确率。

2.读长较短，一般为500至1000个碱基。

3.测序过程复杂，需要进行多次扩增和凝胶电泳分析，耗时较长。

二、二代测序技术

二代测序技术的发展始于2005年，它采用大规模并行的方式进行测序，实现了高通量测序。主要的二代测序技术包括454测序、illumina

测序和Ion Torrent测序。

454测序技术采用循环化学法，通过将DNA片段固定在微小的载体上，然后进行多次扩增和测序，最后通过压缩气体冲击来释放碱基，从而实现

测序。

illumina测序技术采用桥式扩增法，通过将DNA固定在玻璃芯片上

的小孔中，并用荧光标记核苷酸进行扩增和测序，最后通过激光扫描来检

测荧光信号。

Ion Torrent测序技术是一种基于半导体芯片原理的测序技术，通过

检测氢离子的释放来确定DNA序列。

二代测序技术的特点是：

1.高通量：可以同时测序数百万甚至数十亿个片段。

2.快速：通常只需几个小时到几天的时间完成测序。

3.读长较短：大部分二代测序技术的读长在100至1000个碱基之间。

4.相对较低的测序准确率：一般在99%左右。

三、三代测序技术

简述一、二、三代测序技术

一代测序技术

一代测序技术是一种拼接式测序技术，它可以将DNA片段进行拼接，从而得到DNA序列。它是一种基于Sanger方法的技术，通过热板和冷板将DNA片段分别固定在支架上，再使用DNA聚合酶对支架上的DNA片段进行复制，最后通过测序仪来获取DNA序列信息。一代测序技术已经被广泛应用于基因组学研究中，但是它仍然有很多缺点，比如时间短，费用较高，最大的问题是在测序过程中可能出现错误，这种错误很难被确认。

二代测序技术

二代测序技术是一种新的技术，它不需要DNA片段的拼接，而是使用DNA分子组装的方法来提取DNA序列信息。该技术使用高通量测序技术，可以一次性同时测序大量的DNA片段，因此大大提高了测序效率，并减少了出错的几率，同时也降低了测序成本。

三代测序技术

三代测序技术是一种后续的测序技术，它能够更加精确地提取DNA序列信息，使用特殊的测序仪可以同时测定全基因组的DNA序列。该技术采用短片段拼接的方法，可以实现更高精度的DNA序列测序，可以更好地发掘基因组中的变异位点，从而更好地研究遗传病和肿瘤的发生机制。

简述基因一代、二代和三代测序技术原理及其应用范围

一、基因测序技术的发展

1. 基因测序技术的概念及意义

2. 基因测序技术的发展历程

3. 基因测序技术的分类及特点

4. 基因测序技术的应用范围

二、基因测序技术原理及方法

1. 基因一代测序技术原理及方法

2. 基因二代测序技术原理及方法

3. 基因三代测序技术原理及方法

三、基因测序技术在生物研究中的应用

1. 基因一代测序技术在生物研究中的应用

2. 基因二代测序技术在生物研究中的应用

3. 基因三代测序技术在生物研究中的应用

四、基因测序技术在医学诊断与治疗中的应用

1. 基因一代测序技术在医学诊断与治疗中的应用

2. 基因二代测序技术在医学诊断与治疗中的应用

3. 基因三代测序技术在医学诊断与治疗中的应用

五、基因测序技术的发展趋势和展望

1. 基因测序技术的发展趋势

2. 基因测序技术的未来展望

六、结语

在人类基因组项目完成后，基因测序技术得到了长足的发展。基因测序技术已经成为现代生物医学研究的重要工具，其在生物学研究、医学诊断与治疗等领域发挥着重要作用。基因测序技术主要分为一代、二代和三代测序技术。本文将对这三种基因测序技术的原理、应用范围等进行详细阐述，旨在全面了解基因测序技术的发展和应用。

一、基因测序技术的发展

1. 基因测序技术的概念及意义

基因测序技术是指通过化学或物理方法对DNA序列进行测定，进而推导出蛋白质的氨基酸序列的技术。基因测序技术的发展对于了解生命活动、疾病的发生机制、药物研发等方面具有重要意义。

2. 基因测序技术的发展历程

基因测序技术的发展经历了多个阶段，自20世纪末以来，随着技术的不断进步和成本的降低，基因测序技术得到了迅速发展和广泛应用。

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一代测序二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比

一代测序（Sanger测序）是最早的测序技术，使用DNA聚合酶扩增

特定区域的DNA片段，并通过合成带有不同碱基的荧光标记引物进行测序。一代测序的优点是高可靠性和准确性，能够得到较长的读长，适用于小规

模的基因组测序和位点测序。不过，一代测序存在的缺点是昂贵、耗时且

无法进行高通量测序，适用于较小规模的实验。

二代测序（高通量测序）是目前最为常用的测序技术，如Illumina

和Ion Torrent等商业平台。二代测序基于串联的扩增反应，DNA模板被

分成数百万小片段，每个片段通过扩增、聚合和测序步骤进行处理。二代

测序具有高通量、较低的成本和快速的测序速度等优点，能够同时测序多

个样本。缺点是读长比较短，通常为几百个碱基对。二代测序主要应用于

全基因组测序、转录组测序、表观基因组测序等大规模测序项目。

三代测序（单分子测序）是较新的测序技术，如PacBio和Oxford Nanopore等商业平台。三代测序通过直接测量单个DNA分子的顺序来进

行测序，不需要扩增反应。三代测序的优点是具有极长的读长，可以达到

几十万个碱基对，能够测序重复序列和大的结构变异。缺点是较高的错误

率和较低的测序准确性。三代测序主要应用于长读长测序、基因组组装和

变异检测等需要长reads的研究。

总结起来，一代测序适用于小规模的实验，提供高质量的数据，但成

本昂贵和耗时。二代测序适用于大规模的测序项目，具有快速、高通量和

较低的成本等优点，但读长较短。三代测序适用于长读长测序和大结构变

异的分析，但错误率较高。根据研究需求选择合适的测序技术，或者结合

一代-二代-三代测序原理

二代测序
文库的构建
• a类微生物等的基因组DNA：采用酶或者超声波将基因组打断，然后用DNA聚合酶补平，
并在3‘加一个A碱基；
• b类人等超大片段基因组：采用转座酶，Tn5本身是一个DNA转座子的转座酶，它可以带
着自己的DNA在基因组上到处插入，研究人员就借用了Tn5的这个特点将其用于文库构建。
• c类基因组RNA：采用酶或者超声波将基因组打断，然后随机引物进行反转录pcr，然后DNA聚合酶在cDNA的3‘加
➢ 二代测序和一代测序最大的不同点在于其边合成边测序技术。
二代测序
二代测序
测序流动槽(flowcell)：每个槽都有共价交联的两种oligo（P5和P7），分别与文库两端的接头互补。
DNA聚合酶
P5 P7
桥式PCR合成另一条链
NaOH解开双链
NaOH解开双链后模板链被洗掉
二代测序
流动槽加入引物 Rd1 SP、DNA 聚合酶、荧光标记的dNTP，对第一条链测序
➢ 三代测序读长长，遇到大基因组测序，在极短时间内完可成拼接。
优势2 来自百度文库无GC偏好性
➢ 测序不受GC含量的影响，因为构建文库过程无需PCR反应，PCR反应GC含量高的片段比GC含量低的片段扩增慢，所以二代测序GC含量高的片段出现概率要低。
三代测序
优势3 ：高准确率

一代测序与二代测序的区别与联系

Sanger 法测序（一代测序）

Sanger 法测序利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在 G、A、T 或 C 处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs 和 ddNTPs 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用 X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

高通量测序（二代测序）

高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统 Sanger 测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。

第一代和第二代测序技术

----资料来源于文献：尹银亮、陈会平、毛良伟《新一代DNA测序技术总览》-----精心整理，希望对您有所帮助!

四种测序对比（四代测序比较）

原理应用

一代测序DNA双脱氧核苷酸末端终止法，即在测序过程中掺入四种不同的ddNTP，

由于ddNTP末端没有羟基，所以双链

无法继续延伸，DNA合成终止。这样

合成的终产物包括了很多长短不一的

片段，利用电泳分离该混合物，依据

电泳条带即可读出片段序列。

第一次人类全基因组测序

二代测序边合成边测序，即将待测序列变性后锚定与于固相表面，在每一个待测序

簇进行延伸互补时，每加入一个被荧

光标记的dNTP就会释放出对应的荧

光，通过对荧光信号进行捕捉来转换

成测序峰图，继而得到待测片段的序

列信息，通过生物信息学工具将可以

将片段信息进行组合，得到整个基因

中国大熊猫种群测序，大规模基因组

测序，宏观了解基因组和基因组学相

关信息

三代测序基于纳米孔相关技术的单分子测序技术，或可称为直接测序技术。首先建

立纳米级别的孔径，使DNA分子单独

通过孔径，由于碱基化学组成不同，

其电导率也不同，根据电导率可以直

接读出相应的碱基序列。

某些罕见病的低突变率位点鉴定

基因芯片基因芯片技术基于DNA杂交原理，通

过将数以万记的寡核苷酸探针固定于

面积很小的固相上制成阵列，将待测

序列用荧光进行标记，待测序列与核

酸探针互补，洗脱后确定荧光强度最

强的位置，获得该组探针的序列，通

过生物信息学工具重组靶核苷酸全部

序列。

农作物筛选和代谢酶相关基因检测

测序方法比较

优势劣势

技术原理简单，成本低基于PCR技术，对DNA合成质量要求很高。每次只能读取一条序列。测序长度有严格的限制。

快速，操作简便，成本较低基于PCR技术，对DNA合成质量要求很高。测序长度有严格的限制。后续结果处理需要大量生物信息学支持。

一代二代三代测序原理

一代、二代和三代测序技术在测序原理上有一定的区别。下面为您详细介绍这三代测序技术的原理：

1. 一代测序（Sanger测序）：

一代测序，也称为Sanger测序，是由英国生物化学家Frederick Sanger 发明的一种测序方法。其核心原理是双脱氧链终止法，利用DNA复制过程中的终止现象进行测序。

在Sanger测序反应中，包含目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物和DNA聚合酶等。测序反应的关键是使用的ddNTP，由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力。这些ddNTP可以用来中止DNA链的延伸。

在测序过程中，设置多个反应体系，分别加入引物、DNA聚合酶、四种dNTP和一定比例的ddNTP（带有放射性标记）。例如，第一个体系中加入ddATP，负责测定T碱基的位置；依次加入ddCTP、ddTTP和ddGTP，分别测定C、T和G碱基的位置。扩增过程中，ddNTP结合到相应的测序位点，最后通过凝胶电泳和放射自显影检测带有荧光标

记的ddNTP，得到测序序列。

一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但通量低、成本高。目前，一代测序在验证序列和验证基因组组装完整性方面被认为是金标准。

2. 二代测序（高通量测序）：

二代测序，也称为高通量测序技术，相较于一代测序，具有更高的通量。它一次可以同时测序大量的序列，从而满足对一个物种或样本中所有序列信息进行分析的需求。

二代测序的核心原理是测序by synthesis（测序合成法），利用DNA聚合酶和测序引物在模板DNA上进行实时测序。在测序过程中，将DNA 随机打断成小片段（如250-300bp），然后通过建库和富集这些DNA 片段。建库后的样本放入测序仪中进行测序，测序仪中有着不同的测序深度，根据碱基互补配对原则，读取测序数据并拼接成完整的序列。

一代测序、二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比

一、初现庐山真面目

——一代测序：又称Sanger测序（多分子，单克隆）

历史：第一代DNA测序技术（又称Sanger测序）在1975年，由Sanger等人开创，并在1977年完成第一个基因组序列（噬菌体X174），全长5375个碱基。研究人员经过30年的实践并对技术及测序策略的不断改进（如使用了不同策略的作图法、鸟枪法），2001年完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。

原理：在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。

二、江山辈有人才出

——二代测序：NGS技术（多分子，多克隆）

背景：Sanger测序虽读长较长、准确性高，但其测序成本高通量低等缺点，使得de novo测序、转录组测序等应用难以普及。经过数据不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术，ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生，后起之秀Thermo Fisher的Ion Torrent技术近年来也杀入历史舞台。

1、Illumina 原理：

桥式PCR 4色荧光可逆终止激光扫描成像

主要步骤：

①DNA文库制备——超声打断加接头

一代、二代、三代基因测序技术的发展历史及应用

核心技术2：可逆终止子
核心技术1：桥式PCR扩增
靶向测序的建库策略: 杂交捕获 vs 扩增子测序
杂交捕获
扩增子测序
与目标片段互补的生物素化探针，使其与目的片段进行杂交，达到将目的基因片段富集的目的。
针对感兴趣的目标区域，设计多重PCR引物进行扩增富集并进行测序的技术。
二代测序的技术平台——Illumina/Solexa
Illumin a
2006年Solexa公司推出了 Genome Analyzer系统
2008年ABI与Invitrogen合并成为Life technologies公
司
2007年Illumina公司收购了 Solexa
2010年life收购Ion Torrent
2013年Life 被Thermo Fisher收购，包括ABI SOLID和Ion-Proton
还推出了MGISEQ-T7，从8G到6T通量的覆盖
2022年10月推出DNBSEQ-T10x4、 DNBSEQ-T7高通量测序仪
二代测序的技术平台——Roche/454
Roche/454技术原理： 1. Preparation 喷雾法将待测DNA打断成
300-800bp长的小片段，两端加上不同的接头； 2. Emulsion PCR 乳液PCR ；
罗氏454 GS测序仪器参数对比

基因测序的前世今生（一代测序,二代测序,三代测序最详原理）

测序技术的前世今生

测序技术的发展历程

第一代测序技术（Sanger测序）

第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）,在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。

原理：ddNTP的3’无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

第二代测序技术(NGS)

第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。

1.illumina

Illumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75%以上，以HiSeq系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4步：

一代、二代、三代测序技术

(2014-01-22 10:42:13)

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第一代测序技术-Sanger链终止法

第二代测序技术-大规模平行测序