桑树分子生物学研究进展

桑树分子生物学研究进展王钰婷，汪泰初，李瑞雪，王伟（安徽省农科院蚕桑研究所，安徽合肥230061）摘要：桑树是多年生木本植物，具有良好的经济效益、生态效益和社会效益。

遗传改良在桑树资源可持续发展中起到关键作用，现代分子生物学技术的迅速发展为之带来了新的机遇和挑战。

近年来，桑树分子生物技术研究取得了重要突破,显示出独特的优势和巨大的发展潜力。

概述了桑树分子生物学研究进展，包括分子标记技术、转基因技术、筛选基因耐型、桑树育种等，并对桑树分子生物学研究的应用前景进行讨论，以期为桑树分子生物学的进一步研究提供参考资料。

关键词：桑树；分子生物学；改良；基因转化中图分类号：S888.3+1文献标识码：A文章编号：1004-874X（2013）12-0153-03Research advances on mulberry molecular biologyWANG Yu-ting,WANG Tai-chu,LI Rui-xue,WANG Wei(The Sericultural Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei230061,China)Abstract：Mulberry is a perennial woody plant with a huge economic,ecological and social value.Genetic improvement programs play a crucial role in the sustainable management of mulberry resources.The rapid development of modern molecular biotechnology brings new opportunities and challenges to mulberry improvement.Molecular biotechnology has already shown great application potential for mulberry improvement.The recent advance on molecular biology of mulberry,including its molecular markers,transgenic technology, screening for genotypic stress tolerance and mulberry breeding were summarized in this paper.Moreover,the perspective applications of molecular biotechnology to mulberry genetic improvement were also discussed.This work provides a reference for further study of the molecular biology of mulberry.Key words：mulberry;molecular biology;amelioration;genetic transformation桑树是一种多年生木本植物，属于蔷薇目（Rosales）桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）桑种（Morus alba L.）[1]。

作为家蚕的唯一饲料，桑树良种是发展蚕业生产的重要物质基础，种植优良桑树品种不仅可以提高桑叶产量和质量，增加蚕桑生产经济效益，而且对茧丝绸的品质改善也起着重要作用，具有重要的生态和经济价值。

桑树分子生物学研究始于20世纪80年代，随着现代分子生物学及其技术的快速发展，现代先进研究手段逐步应用于桑树研究，桑树分子生物学研究得到了长足发展，对桑树种质资源的研究也由早期的种质资源鉴定、分布调查及形态学特征等方面的基础研究，逐步深入到桑树种质资源分子生物学研究的发展阶段。

本文对分子生物学技术在桑树中的研究现状进行综述，以期为桑树分子生物学的进一步研究提供参考。

1桑树DNA分子标记技术分子标记是以DNA多态性为基础的遗传标记，是DNA水平遗传变异的直接反映。

近年来，随着分子生物学及其技术的快速发展，分子标记技术广泛应用于各种作物的种质资源鉴定与分类、遗传图谱构建、基因定位以及育种中。

DNA分子标记技术能对不同发育时期的个体、所有组织器官甚至细胞作检测，具有多肽性高、多等位基因、遍及整个基因组且不受组织和环境及其他因素影响等特点。

当前DNA分子标记已广泛应用于作物遗传资源与育种研究，分别被称为分子种质资源鉴定和分子标记育种[2]。

DNA 分子标记可以克服形态学鉴定以及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题，因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。

桑树是重要的经济作物，但分子标记技术在桑树上的应用较晚。

1993年，杨光伟等[3]采用显性分子标记RAPD 技术对我国桑树现行分类的15个种、4个变种及近缘属的48份供试材料进行桑属种群遗传结构分析，结果表明桑树具有丰富的遗传多样性，多态位点百分率为78.95％。

向仲怀等[4]利用RAPD技术研究了PCR反应条件，构建了桑属9个种的共9种材料基因DNA指纹图谱，对桑属植物分类进行了探索性研究。

之后，楼程富等[5]、赵卫国等[6]、Bhattacharya等[7]利用此技术对桑树不同种质资源进行了多态性分析，为构建桑树遗传图谱、分子辅助育种、重要农艺性状基因定位和系统分类等提供了重要理论依据。

随着分子生物学的发展，新的分子标记技术不断出现，ISSR（Inter-simple sequence repeats）标记在桑树中是最常见的分子标记，并可结合RAPD（Randomly amplified polymorphic DNA）[8]和SSR（Simple sequence repeats）[9]研究桑树品种的遗传变异。

因SNP（Single nucleotide收稿日期：2013-03-25基金项目：安徽省农科院院长青年创新基金（13B0632）；国家蚕桑产业技术体系合肥综合试验站（CARS-22-SYZ09）；安徽省农科院创新团队项目（11C0610）作者简介：王钰婷（1985-），女，硕士，助理研究员，E-mail：wangyuting656@通讯作者：汪泰初（1970-），男，硕士，研究员，E-mail：18949853828@广东农业科学2013年第12期153polymorphism）在任何生物基因组中都具有最丰富多态性，以单碱基变化作为标记，可以帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记。

但至今尚未见关于桑树SNP的报道。

桑树SNP检测可以对候选基因的表型变异、数量性状位点（QTL）图谱、遗传多样性评估进行关联分析，并可对新型农作物品种进行共线性比较，为基因研究提供一条新的途径。

2桑树转基因技术桑树转基因技术是指通过cDNA文库调取或PCR技术、人工合成等直接分离或克隆途径获得目的基因，通过适当载体转移到桑树基因组中，使桑树定向获得新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。

目前在桑树的遗传转化中获得转基因植株的方法主要有叶盘转化法、基因枪法、茎尖转化法和整株转化法。

基因转化的细胞或组织要根据转化基因的不同，及时选用适宜的选择性标记基因，在一定时间和适宜的条件下进行筛选。

目前常用的筛选标记基因主要有两大类：抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。

大量研究表明，桑树是比较理想的外源基因受体。

1990年日本学者Machii[10]通过农杆菌介导将β-葡萄糖昔酸酶（GUS）基因导入桑树叶盘并在桑叶中成功表达，进一步证明了桑树细胞或组织是外源基因的良好受体。

自此，国内外许多学者在桑树转基因领域进行了大量的研究和探索。

到目前为止，已有抗菌肽基因[11-12]、大豆球蛋白基因[13]、几丁质酶基因[14]、水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因[15]和GUS基因[16]成功转入桑树组织细胞。

Bhatnagar等[17]通过基因枪和农杆菌介导成功获得了转基因印度桑（Morus indica）；Das等[18]通过根瘤土壤杆菌成功转化成熟叶，转化率高达90%，已被证明是一种快速、高效的转化系统。

功能性证据表明，Hva1基因的表达在抗应激反应中具有里程碑的意义[19-20]。

Lal等[21]通过农杆菌转化法，将过表达的大麦Hva1基因成功转入桑树中，生理、生化和分子水平的详细数据显示：过量表达大麦耐寒基因Hva1后，转基因桑树株系在形态学上与未转基因株系基本一致，且具有良好的耐旱、耐盐和耐寒性，田间试验结果也表明转基因株系比非转基因株系表现更为良好。

2009年，Das等[22]首次尝试通过β-胡萝卜素羟化酶-1基因的过表达，成功操纵了类胡萝卜素的生物合成途径。

试验显示转基因桑在高温、强光、紫外线辐射胁迫下表现高胁迫抗性。

通过超高效液相色谱法（UPLC）分析显示，转基因植物与非转基因植物相比，在胁迫环境下聚集了更高水平的叶黄素。

3筛选基因耐型桑树种植受多种胁迫负面影响，干旱和盐碱是最具破坏性的，几乎50%的桑园种植面积受到干旱和半干旱影响。

Hossain等[23]、Vijayan等[24]通过盐胁迫下桑腋芽的培养对筛选耐盐细胞系作了初步尝试，以体外条件下不同基因型桑树种子萌发率来评定植株耐盐性。

在印度桑品种中，盐胁迫效应也可以通过生理和生化参数来研究，如游离脯氨酸积累、光合产量、硝酸还原酶活性、细胞膜稳定性、相对含水量、碳同位素分辨率等[25-26]。

以上分析可以通过细胞转运子，如MiNHX在对比基因型中的表达分析来加以补充证明。

抗旱性桑树基因型的筛选已开始近20年，干旱条件下节点外植体培养已作为一种有效的评价技术用于模拟干旱条件下筛选桑基因型[27]。

目前，在现有的基因库中，干旱胁迫耐受与高产、相对含水量、抗氧化酶活性、脯氨酸积累、甘氨酸甜菜碱含量和ABA含量的增加相关[28]。

Das等（2011年）对10个基因型桑在盐碱和干旱胁迫下进行了筛选，并比较了胁迫应答基因，如HAL3a、脱水蛋白、NHX1和ABC转运蛋白的表达谱。

细菌和真菌性叶斑病、白粉病、叶锈病、根结线虫是桑树的主要疾病，它不仅使桑叶生产力下降10%~20%，也极度影响桑叶品质。

因此，将具有稳定抗性的桑树种质与育种计划结合研究至关重要。

然而，单个或多个抗性基因的确定需要进一步的定性和定量的遗传分析。

为探讨抗性，已有科学家在探索抵抗细菌[29]和病原真菌[30]的桑树种质的栽培育种和育种路线上做了不懈努力，但成果有限。