第3章 酶的生物合成

二、发酵条件的控制及对产酶的影响
1、温度
枯草杆菌的最适生 长温度为34～37℃
黑曲霉的最适生长 温度为28～32 ℃
通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍， 所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影 响其生长和合成酶。
有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长 最适温度有所不同，而且往往低于生长最 适温度。这是由于在较低的温度条件下， 可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加 酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产 量。有些酶的发酵生产，要在不同阶段控 制不同的温度条件。在生长繁殖阶段控制 在细胞生长最适温度范围内，以利于细胞 生长繁殖，而在产酶阶段，则需控制在产 酶的最适温度。
生产上对pH 的控制和调节的方法： ① 调节培养基初始pH值，控制合适的C/N， 调整生理酸性物质与生理碱性物质之间的 比例。 ② 补料调节，即通过发酵过程中流加碳源、 氮源来调节pH值 ③ 添加缓冲液，维持一定的pH值 ④ 如pH值变化较大，可直接加酸或碱进行调 节。 ⑤ 通过对溶解氧的调节，来控制中间代谢产 物的氧化程度。
．生长因子
生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的 微量有机化合物主要包括各种氨基酸、嘌 呤、嘧啶、维生素，以及动植物生长激素 等。 在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进 玉米浆、酵母膏等天然原料。其中玉米浆 最常用。
5、产酶促进剂
在培养基中添加某种少量物质，能显著提 高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。 诱导物 表面活性剂 表面活性剂能够增加细胞透性，其处在气 -液界面改善了氧的传递速度，还可以保护 酶的活性，另外还可消泡提高氧传递系数。
培养基的pH在细胞生长繁殖和代谢物产生的过程中往往 会发生变化。这种变化与细胞特性有关，也与培养基的组 分密切相关。含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸， 会使培养基的pH向酸性方向移动；含蛋白质、氨基酸 较多的培养基，经代谢产生较多的胺类物质，使pH向碱 性方向移动；以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被细胞利用， 使培养基pH下降；以尿素为氮源时，先随着尿素被脲酶水 解生成氨，使培养基pH上升，然后又随着氨被细胞同化而 使PH下降；磷酸盐的存在，对培养基的pH起一定的缓冲作 用。 所以在细胞培养和发酵过程中，必须对培养基的pH进行适 当的控制和调节。PH的调节可以通过改变培养基的组分或 其比例来实现。必要时可使用缓冲溶液，或流加适宜的酸、 碱溶液，以调节控制培养基中pH变化。
第一节 酶发酵生产用微生物菌种
微生物菌种是发酵生产酶的首要条件。 目前投入工业发酵生产酶的菌种包括细菌、 放线菌、酵母菌、霉菌等。
一、酶发酵生产用菌种的要求
产酶量高，具有生产应用价值； 易培养，即能适应大生产粗放的营养和培养条件， 包括廉价原料，对工艺条件要求不苛刻； 代谢速率高，发酵周期短； 产酶稳定性好，菌种的生产性能不易退化，不易 感染噬菌体； 安全可靠，要求菌种不是致病菌，其代谢安全无 毒，在系统发育树上最好与病原体无关； 选用产胞外酶的菌种，有利于酶的分离提取。
第三章 酶的生物合成与发酵生产
1.酶发酵生产用微生物菌种 2.酶发酵工艺及控制 3.提高酶产量的方法 4.酶发酵动力学 5.动植物细胞培养产酶
生物体内酶合成的过程称为酶的生物合成。
利用微生物代谢活动生产所需酶的过程， 称为酶的发酵生产。
微生物酶的开发应用： (1)微生物生长繁殖快，生活周期短。因此，用微生物来生 产酶产品，生产能力（发酵）几乎可以不受限制地扩大， 能够满足迅速扩张的市场需求。
3．无机盐
无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少 的无机元素，并对培养基的PH、氧化还原电位和 渗透压起调节作用。 根据细胞对无机元素需要量的大小，可分为主要 元素（大量元素）和微量元素两大类。主要元素 有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。微量元素有： 铜、锰、锌、钼、钴、碘等。微量元素是细胞生 命活动不可缺少的，但需要量很少，过量反而会 引起不良效果，必须严加控制。
2、溶解氧的供给
固定化细胞在进行培养和发酵过程中，由于 受到载体的影响，氧的溶解和传递受到一定的阻 碍作用。特别是采用包埋法制备的固定化细胞， 氧要通过凝胶层扩散到凝胶粒内部，才能供细胞 应用，使氧的供给成为主要的限制性因素。为此， 必须增加溶解氧的量，才能满足细胞生长和产酶 的需要。由于固定化细胞反映器均不能采用强烈 的搅拌，以免破坏固定化细胞，所以，增加溶解 氧的主要方法是加大通气量。例如，游离的枯草 杆菌细胞发酵生产α-淀粉酶，通气量一般控制在 0.5∽1 m3/(m3.min),而采用固定化细胞发酵，其 通气量要1∽2 m3/(m3.min),或者更多。
(2)微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而 且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方 式，能分解利用不同的底物。 (3)这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。 (4)特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几 乎都能够利用微生物细胞获得。 因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获 得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。
不同的细胞对各种碳源的利用情况大不相同，所以在配制 培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择适宜的碳源。 在酶的发酵生产中，除了要从营养的角度考虑碳源的选择 以外，还要考虑到碳源对酶生物合成的调节作用，主要要 考虑酶生物合成的诱导作用以及是否存在分解代谢物作用。 在选择碳源时应尽量选用对所需的酶有诱导作用的碳源， 而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。例如， α-淀粉酶的发酵生产中，应选用对该酶有诱导作用的淀 粉作为碳源，而不用对该酶的生物合成有分解代谢物阻遏 作用的果糖作为碳源。β-半乳糖苷酶发酵应选用乳糖为 碳源，而不用或少用葡萄糖为碳源等等。 在选择碳源时，必需考虑原料的供求和价格问题。
3、溶解氧的控制
培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶 解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时 间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。 一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时 间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养 液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧 速率有明显影响。 调节通气量 调节氧的分压 控制溶解氧方法 调节气液接触时间 调节气液接触面积 改变培养液的性质
3. 菌种的初筛
4. 菌种的复筛 5. 产酶最佳条件的确定
6. 微生物产酶性能的进一步提高
① 经诱变获得高产菌种突变体 ② 利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生 物的酶产量。 ③ 运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌 株中的目的基因转移到另外一些对生产环 境适应性更强的微生物细胞内，使其高效 表达。
各种无机元素的功用各不相同，有些是细胞的主 要组分，如：磷、硫等；有些是酶的组分，如： 磷、硫、锌、钙等；有些是酶的激活剂或抑制剂， 如：钾、镁、铁、锌、铜、锰、钙、钼、钴、氯、 溴、碘等；有些则是对pH、渗透压、氧化还原电 位起调节作用的，如：钠、钾、钙、氯、磷等。 其中磷是特别重要的元素，它是构成核酸和磷脂 的成分。微量元素有的是某些酶的组成成分，有 的是酶的激活剂，也有的是辅酶的必需成分。
在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新陈 代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升 高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基 温度降低，两者综合，决定了培养基的温度。由 于在发酵的不同阶段，细胞新陈代谢放出的热量 差别很大，扩散和散失的热量受到环境温度等因 素的影响，使培养基的温度变化明显。为此必须 经常及时地进行调节控制，使培养基的温度经常 维持在适宜的范围内。温度控制的方法一般采用 热水升温，冷水降温，故此在发酵罐中，均设计 有足够传热面积的热交换装臵，如排管、蛇管、 夹套、喷淋管等。
① 不同的细胞对各种氮源的要求各不相同， 应根据要求进行选择和配制。一般说来， 动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求 无机氮，微生物细胞中，异养型微生物用 有机氮，自养型微生物用无机氮。 ② 碳和氮两者的比例对酶的产量有显著的影 响。所谓碳氮比（C/N）一般是指培养基 中碳元素（C）的总量与氮元素（N）总量 之比。可通过测定或计算培养基中碳和氮 的含量而求出。 ③ 有的氮源及其浓度如氨基酸的变化对酶发 酵有代谢调节作用。
7. 微生物产酶菌种的保藏
斜面保藏 沙土管保藏 冷冻保藏
第二节 发酵工艺条件及控制
一、培养基的营养成分 培养基是指人工配制的用于细胞培养和发 酵的各种营养物质的混合物。 在设计和配制培养基时，应特别注意各种 组分的种类和含量，以满足细胞生长、繁 殖和新陈代谢的需要，并要调节至适宜的 pH。还必须注意到，有些细胞生长、繁殖 阶段和发酵阶段所要求的培养基有所不同， 在此情况下，要根据需要配制不同的生长 培养基和发酵培养基。
2、pH值
① pH影响微生物体内各种酶的活性，从而导 致微生物的代谢途径发生改变。 ② 影响微生物形态和细胞膜的透性，从而影 响微生物对培养基中营养成分的吸收和代 谢产物的分泌。 ③ 影响培养基中某些营养物质的分解或中间 代谢产物的解离，从而影响微生物对这些 物质的利用。
不同细胞生长繁殖的最适pH有所不同。一般细胞和放线菌 的生长最适pH为中性或微碱性（pH6.5～8.0）；霉菌和酵 母的生长最适pH为偏酸性（PH4.0 ～ 6.0）；植物细胞生 长的最适pH为5 ～ 6。 有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培养基的PH，往 往可以改变各种酶之间的产量比例。例如：黑曲霉可生产 α—淀粉酶，又可生产糖化酶。当培养基的PH偏向中性时， 可使α—淀粉酶产量增加而糖化酶减少，反之，当培养基 的PH偏向酸性时，则糖化酶产量提高而α—淀粉酶的量降 低。再如用米曲霉生产蛋白酶，当培养基的PH为碱性时， 主要生产碱性蛋白酶，降低培养基的PH，则主要生产中性 或酸性蛋白酶。
1．碳源 碳源是指能够向细胞提供碳素化合物的营 养物质。通常碳源同时也是提供能量的能 源。 碳是构成细胞成分的主要元素之一，也是 各种酶的重要组成元素。所以，碳源是酶 发酵生产乃至其他产物的发酵生产的必不 可少的营养物质。 目前，在酶发酵生产中最常用的碳源是淀 粉及其水解物，如糊精、麦芽糖、葡萄糖 等。