真核表达质粒pcDNA3.1(+)-DNFGFR1在小鼠BMSCs中的表达及意义

真核表达载体 pcDN A3．1（＋）-G FP-M C1R 的构建及在羊驼毛囊干细胞中的表达

真核表达载体 pcDN A3．1（＋）-G FP-M C1R 的构建及在羊驼毛囊干细胞中的表达白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海【摘要】旨在构建含有 MC1R基因的pcDNA3．1（＋）真核重组表达载体，为进一步研究 MC1R的生物学功能奠定基础。

应用RT‐PCR技术从羊驼皮肤cDNA 文库中扩增 MC1R基因全长cDNA ，然后通过双酶切将 MC1R基因全长cDNA 克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋），然后采用脂质体法转染体外培养的羊驼毛囊干细胞后，通过G418筛选培养，建立稳定的转染体系，直接荧光观察pcDNA3．1／MC1R融合蛋白在细胞中的分布定位，并通过Western Blot方法检测 MC1R在羊驼毛囊干细胞中的表达。

结果表明，成功构建了pcDNA3．1／MC1R重组表达载体，并且发现试验组的毛囊干细胞中表达 MC1R蛋白显著高于空白组（P＜0．05）。

成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3．1／MC1R ，且 MC1R基因在羊驼毛囊干细胞中获得表达。

%It is the base of further study on MC1R biological functions to construct the pcD‐NA3 .1 eukaryotic expression vector of MC1R gene in alpaca .MC1R gene was amplified by RT‐PCR with the cDNA from alpaca skin library .PCR products and pcDNA3 .1 plasmid were digested and recycled by BamHI and EcoRI endonuclease .The positive clones were selected , from which plasmid DNA was abstracted and identified by restriction endonuclease ,sequence identification and sequencing . ThepcDNA3 .1/MC1R recombinant expression plasmid was transfected into alpaca hair follicle stem cells by Lipofectamine TM 2000 .After screening culture by G418 ,a stably‐transfected cell system wasestablished .Fluorescent microscopy was em‐ployed to reveal the localization o f MC1R in alpaca hair follicle stem cells ,and the transcrip‐tion and expression of the MC1R were identified by Western Blot .The results show that eu‐karyotic expression vector pcDNA3 .1/MC1R was successfully constructed .When pcDNA3 . 1/MC1R recombinant expression plasmids were transfected into alpaca hair follicle stem cells , the expression ofMC1R was up‐regulated (P<0 .05) .This study successfully constructed eu‐karyotic expression vector containing green fluorescent protein gene pcDNA 3 .1/MC1R .It c ould up‐regulate the expression of MC1R in alpaca hair follicle stem cells .【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P86-90)【关键词】羊驼;黑素皮质激素受体1;毛囊干细胞;真核表达载体;转染【作者】白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海【作者单位】山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801; 山西医科大学晋祠学院，山西太原 030025;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801【正文语种】中文【中图分类】Q7822种天然毛色是羊驼的非常重要的经济性状之一［1］。

pCDNA 3.1／ EC—SOD真核载体的构建及在巨噬细胞中的表达

pCDNA 3.1／EC—SOD真核载体的构建及在巨噬细胞中的表达目的为明确EC-SOD在动脉粥样硬化发生发展中的作用，课题组体外构建pCDNA 3.1/EC-SOD真核表达载体，并观察其在THP-1单核源性巨噬细胞中的表达情况。

方法重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后，借助Lipofectamine 2000将转染到THP-1单核源性巨噬细胞中，24h后倒置荧光显微镜下观察转染情况。

结果重组质粒经酶切鉴定、PCR和测序分析后，证实pCDNA 3.1/EC-SOD质粒构建成功。

将pCDNA 3.1/EC-SOD通过脂质体转入THP-1单核源性巨噬细胞后，倒置荧光显微镜下观察转染效率。

结论pCDNA 3.1/EC-SOD 载体构建成功，并成功在THP-1单核源性巨噬细胞中表达，为研究EC-SOD在动脉粥样硬化发生发展中的作用奠定了基础。

标签：EC-SOD；THP-1单核源性巨噬细胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种广泛存在于生物体内的金属酶，是体内重要的抗氧化防御系统，包括铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）以及最近日益得到重视的细胞外超氧化物歧化酶（ECSOD）[1]。

EC-SOD是Marklund等在1982年发现的一种分泌型糖蛋白，主要由巨噬细胞和血管平滑肌细胞产生，它是惟一分布在细胞外发挥抗氧化作用的酶，对机体的氧化/抗氧化平衡起至关重要的作用[2，3]。

EC-SOD可以清除脂质过氧化物、减轻氧自由基对组织细胞的过氧化损伤，并能降低脂质过氧化物形成，从而保护血管内皮免受氧自由基的损伤，防止动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的形成[4，5]。

为了更深层次的研究EC-SOD的作用机理，我们构建了PcDNA-3.1/EC-SOD真核表达载体，并成功转染了THP-1单核源性巨噬细胞，为进一步研究EC-SOD的作用奠定了基础。

野生型MLK3真核表达载体的构建及其表达

野生型MLK3真核表达载体的构建及其表达作者：金磊，岳军，杜彩萍，侯筱宇【摘要】目的构建野生型MLK3真核表达质粒并转染至COS-7细胞中表达。

方法以大鼠海马总RNA为模板,通过RT-PCR分段扩增MLK3的序列，采用酶切、链接的方法先将目的基因克隆至pGEM-T，筛选正确的质粒后，再亚克隆至pcDNA3.1(+)。

以脂质体转染法将构建好的重组质粒转染至COS-7细胞，通过免疫印迹鉴定重组质粒的表达。

结果限制性内切酶酶切和测序结果表明，扩增出的野生型MLK3的序列正确。

免疫印迹显示，转染的重组质粒在相对分子质量92×103处有相应条带出现。

结论成功构建了MLK3的真核表达质粒，重组质粒在COS-7细胞中高效表达。

【关键词】MLK3;克隆;真核表达Abstract:Objective To construct the recombinant of wild-type MLK3 eukaryotic expression plasmid and to express the recombinant in transfected COS-7.Methods According to the cDNA sequence of MLK3 (GenBank, BC081952), the sequence of wild-type MLK3 fragments were expanded by RT-PCR, using rat hippocampal total RNA as the template. Then these fragments were cloned into the plasmid of pcDNA3.1(+). The recombinant of pcDNA3.1-MLK3 was transfected into COS-7 cells by themediation of lipofectamine reagents. Immunoblot method was used to determine the expression of MLK3 proteins.Results The target gene was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. The immunoblotting analysis indicated that the recombinant of MLK3 was successfully expressed in COS-7 cells.Conclusion The eukaryotic expression plasmids of MLK3 were successfully constructed and the recombinant plasmid were highly expressed in COS-7 cells.Key words：MLK3; clone; eukaryotic expressionMLK3(Mixed lineage kinase 3)是MAPKKK(Mitogen-activated protein kinases kinases kinases)家族的MLKs亚家族成员，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，它通过磷酸化作用激活丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路的丝/苏氨酸蛋白激酶，介导其下游信号通路激活[1]。

真核表达载体pcDNA3-CaBP—D28k的构建及其在COS-1细胞表达

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州２５０）２０９
摘要：通过酶切方法从克隆质粒ｐＥＴ—ＣＢＤ８ＧＭ— ａＰ— ２ｋ中扩增ＣＢａＰ—Ｄ８基因，２ｋ并将其克隆到真核表达
载体ｐＤＡｃＮ３中。阳性克隆鉴定后，ＰＩ用下转染ＣＳ一１细胞，在Ｅ作Ｏ通过间接免疫荧光试验（Ｆ检测到了ＩＡ）
虽对ＣＢａＰ家族其他成员的基因克隆及载体构建有
合蛋白家族中的一员。它是一种维生素Ｄ依赖性钙结合蛋白，是受活性维生素Ｄ及其代谢产物调节
的细胞内蛋白质，对分子质量为２相８×１Ｄ，有０ａ具Ｅ—Ｆ手臂，螺旋环状结构，与Ｃ结合，接呈可ａ直调节Ｃ转运－］ａＰ—Ｄ８ａ２。ＣＢ２ｋ与细胞内游离钙离子有高度亲和力，介导调节钙离子参与的多种可生理功能－］ａＰ—Ｄ８４。ＣＢ２ｋ首先是从禽肠道中分离出来的，的含量与肠钙吸收量呈正相关Ｊ它。以往对ＣＢａＰ—Ｄ８２ｋ的研究多集中在与钙平衡密切相关的肾、、肠、经系统方面骨小神，年来研近
ＣＢａＰ—Ｄ８２ｋ在ＣＳ一１中的表达。Ｏ
关键词：钙结合蛋白；转染；ＦＩＡ
中图分类号：８１２￥３．文献标志码：Ａ文章编号：０２—１０（０８００６０１０３２２０）３— ０２— ５

真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1构建及意义

真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1构建及意义王笑;严金川;龚杰【摘要】Objective: To construct a recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1 a-FGFR1 .Methods: The fragnent of FGFR1 was amplificated by PCR, after purification the PCR products of FGFR1 and eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1 a were cut and FGFR1 were inserted into pcDNA3. 1 a,and then transformed into DH5α strain and positive clone was selected. The recombinant plasmid was confirmed by restriction endonuclease analysed and sequencing test. Results: DNA sequencing and restriction endonuclease digestion analysis indicated that the eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1 a-FGFR1 was constructed successfully. Conclusion : Construction of pcDNA3. 1 a-FGFR1 eukaryotic expression plasmid was successful. This study for the next step on angiocardiopathy research laid the experimental foundation.%目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1.方法:通过PCR扩增FGFR1目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1a,将扩增的FGFR1基因片段插入pcDNA3.1a线性质粒,即构建成pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒,将质粒转化感受态DH5α菌株,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序鉴定.结果:酶切及测序结果表明pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒构建成功.结论:pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒构建成功,为下一步对心血管疾病研究奠定了一定的实验基础.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(021)004【总页数】4页(P333-336)【关键词】碱性成纤维细胞生长因子1型受体;pcDNA3.1a载体;真核表达质粒;心血管疾病【作者】王笑;严金川;龚杰【作者单位】江苏大学附属医院心血管内科,江苏,镇江,212001;江苏大学附属医院心血管内科,江苏,镇江,212001;江苏大学附属医院心血管内科,江苏,镇江,212001【正文语种】中文【中图分类】R393成纤维细胞生长因子1型受体(fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1)属于酪氨酸激酶受体家族［1］，是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的高亲和性受体，主要通过与配体bFGF结合后作用于血管平滑肌细胞，促进其增生与分化［2］。

真核表达质粒PcDNA3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)的构建及其在体内外细胞中的表

中国实验诊断学２１年１第１卷箜塑０１月５文章编号：０７２７２１）１０１０１０ —４８（０１０ —０１ — ４
பைடு நூலகம்
真核表达质粒ＰＤＡ．（一有白蛋白信号肽ｅＮ３１＋）带的Ｖｓｓｔ（２ —８ａ）ａｏｔｉ１０１０ａ的构及其在体内外ａｎ建
用该质粒治疗全身新生血管类病奠定了一定基础．关键词：ａｏｔｎ１０１０ａ；９Ｔ细胞；Ｖｓｆ（２－８ａ）２３ｓａｉ基因克隆；真核表达
中图分类号：７２Ｑ８文献标识码：Ａ
ＩｃｄｇＡｂｍＩｅｔｅＶｓｓｔ１０１０ａｅｅＣｏｅａｄＩｘｒｓｉｕａｙｆｅｓＬＵＪｎ，ｎｌｉｌｉｕｎｕａｐｐｉａｏｔｉ２－８ａ）ＧｎｌｎｔＥｐｅｏｉｅｋｒｏｃＣｌＩｉ￣ｌｄａｎ（ｎｓｓｎｎｉｌａ
ＧＡＵＮ一ｉＷＮＧＬｎｅａ．ｋ，Ａｉ，ｔ１（ｕ
Ｆｒｉｔｓ４
ＨｓｉｌｆＨｒｎＭｅ＆Ｕｉｒｔ，ａｉ１００，ｈａｏｔａｉｄｄｎｅｉＨｒｎ５０１Ｃｉ）ｐａｏ６ｖｓｙｂｎ
ＡｓａｔＯｂｅｔｅＴｏｓｕｔｈｃｍｉｄｐｍｉＰＤＡ．（一ａｏｔｉ（２—８ａ）ｉｌｉｌｉｎｓｎｌｂｔｃ：ｊｃｉｏｃｎｔｃｔｒｏｂｎｌｄｅＮ３１＋）Ｖｓｓｔ１０１０ａｎｕｎＡｂｉａｒｖｒｅｅｅａｓａｎｃｄｇｍｇ

真核表达载体pcDNA3.1(+)-vIL-10的构建及其在SD大鼠骨髓基质干细胞的表达

Ｗｅａｇ２１３ｈｎ）ｉｎ６０１Ｃｉａｆ
【ｂｔｃ】ＯｊｃｖＴｎｔｃａｕａｏｃｘｒｓｎｅｔｃｄｇｌ一０ＤＡａｄｏｎｅｔａｓＡｓａｔｒｂｅｔｅｏｏｓｕｔｋｒｔｐｅｉｃｒｎｏｉＬ１ｃＮｖｓｇｔｉｉｃｒｅｙｉｅｓｏｖｏｅｎｖｎｔｉｉｅｔ
ｐｏａｙｔｅｔｒＰＴ一８ＯｖＬ０ａｄａｌｅｎＥｃｌＪ０ｎｌｎｄｉｔｈｕａｙｔｘｒｓｉｎｖｃｏｒｋｒｏｉｖｃｏＥ２ｔ／Ｉ一１ｎｍｐｉｄｉ．ｏｉＭ１９ａｄｃｏｅｎｏｔｅｅｋｒｏｉｅｐｅｓｏｅｔｒｃｉｆｅ
察免疫调节因子ｖＬ１ｌ一０在骨髓基质干细胞的表达。方法ＰＲＣ扩增原核载体ＰＴ２ｖＬ１，获得目的基因Ｅ一８Ｉ一０ｄ／经ＰＲ、酶切、测序ＣｖＬｌ一ｖＬ１，目的基因在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体ＰＤＡ．＋），转染大鼠骨髓基质干细胞。用Ｇ１筛Ｉ一０ｃＮ３１（４８选得到ｖＬ１高表达的细胞，对照组为ｐＤＡ．＋）直接转染的骨髓基质干细胞。结果ｌ一０ｃＮ３１（鉴定显示按设计构建的载体ｐＤＡ．＋）一ｖＬ１，已成功转染骨髓基质干细胞。Ｒ — Ｃ检测到５０ｐ目的片ｃＮ３１（Ｉ一０ＴＰＲ１ｂ段ｖＬ１在骨髓基质干细胞表达，ＳＳＰＧ电泳表明在骨髓基质干细胞有ｖＬ１蛋白的表达。结论Ｉ一０Ｄ—ＡＥＩ一０１ｍＲＡ０Ｎ和蛋白在骨髓基质干细胞中表达。

重组质粒pcDNA3_1_CD44v5的构建及意义

随着分子医学和肿瘤病因研究的不断深入，肿瘤免疫治疗逐渐成为肿瘤治疗的活跃领域，现已从基础研究逐步过度到临床应用，并已显现出良好的应用前景。

在提高消化系统恶性肿瘤治疗效果、延长生存时间、降低放疗和化疗不良反应方面将发挥重要作用[1，2]。

CD44是一种黏附因子，为分布极为广泛的一组细胞表面跨膜糖蛋白，参与细胞与细胞、细胞与基质之间的特异性粘连，是肿瘤共同表达的肿瘤转移标志物之一[3]，对肿瘤的诊断和治疗具有重要的意义，特别是CD44v5是恶性肿瘤共同表达的特异性抗原，与肿瘤的发生、浸润和转移关系密切，能被作为肿瘤发生、发展和预后的指标[4]。

如果将作为共同抗原-肿瘤侵袭和转移特异性抗原CD44v5导入树突状细胞（dendritic cell，DC），用于肿瘤的免疫治疗，这样既可以避免自身抗原诱发自身免疫性疾病，同时又可诱导强烈的特异性抗肿瘤反应。

本实验采用分子生物学技术，构建针对CD44v5的pcDNA3.1载体，为探讨肿瘤的免疫治疗奠定一定的基础。

1材料与方法1.1材料1.1.1菌株与质粒：Top10和E．coli DH5α细菌和质粒pcDNA3.1为本校病毒性肝炎研究所赠送。

1.1.2主要试剂及来源：总RNA提取试剂盒（Trizol）、DEPC和T4DNA连接酶购自北京天为时代公司；M-MLV Reverse Tran-scriptase、Taq DNA polymerase、KpnI和XhoI限制性内切酶、DNA Marker(DL2000)等购自Takara大连公司；DAB显色试剂购自北方中杉金桥生物技术有限公司；GoldviewTMDNA染料购自北京赛百盛基因技术有限公司；Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；CD44v5抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2实验方法1.2.1总RNA提取及其逆转录：从-80℃冰箱中取出人胃癌组织100mg，放入研磨器中，加入液氮迅速研磨成粉状；加入Tri-zol1ml，迅速抽打混匀；加入氯仿100μl，剧烈振摇15秒，室温孵育15分钟，4℃，13200r/min离心15分钟，使溶液分成三相；小心吸取上层含RNA的水相，移入新的EP管中；加入250μl异丙醇，颠倒数次以混匀，室温孵育10分钟以形成RNA沉淀，4℃，13200r/min离心10分钟，弃上清；每管中加入500μl75%乙醇洗涤RNA，4℃，10000r/min离心5分钟，弃上清；空气干燥10 min。

pcDNA3.0-CBP真核表达质粒的构建及对肺腺癌SPC-A1细胞的影响

·１４２０·ｐｃＤＮＡ３．０－ＣＢＰ真核表达质粒的构建及对肺腺癌ＳＰＣ—Ａ１细胞的影响周栋魏万胜苏云峰王志强王成苟云久【摘要】目的观察外源性ＣＢＰ基因稳定转染对人肺腺癌ＳＰＣ－Ａ１细胞体外牛长的影响。

方法构建ＣＢＰ真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．０．ＣＢＰ，应用ｐｃＤＮＡ３．０－ＣＢＰ和窄载体质粒ｐｃＤＮＡ３．Ｏ（一），脂质体转染法转染体外培养的人肺腺癌细胞株ＳＰＣ—Ａ１，Ｇ４１８（８００ｍｓ／Ｌ）筛选出抗性克隆。

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测转染前后ＣＢＰ蛋白水平变化，噻唑蓝（Ｍ１Ｔｒ）比色法分析细胞生长抑制作用，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ体外侵袭实验和Ｗｏｕｎｄ．ｈｅａｌｉｎｇ实验对细胞进行侵袭和迁移能力研究。

结果转染ＣＢＰ基因的细胞株有目的基因整合和相应蛋白高表达。

ＭＴＹ检测ｐｃＤＮＡ３．０－ＣＢＰ转染组活细胞吸光度（Ｏ．２７８７±０．０７８６）低于未转染组（０．５０８９±０．１３０１）和ｐｅＤＮＡ３．Ｏ（一）空载体转染组（０．４８０４±０．１５４７）。

ｐｃＤＮＡ３．０－ＣＢＰ转染组与两对照组吸光度的差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。

细胞侵袭实验表明ｐｃＤＮＡ３．０．ＣＢＰ转染组穿透滤膜数（３．５２±０．７７）明显少于未转染组（８．１７±０．８６）和空载体转染组（８．２２±１．３０），转染组与两对照组侵袭力的差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。

细胞迁移实验转染组细胞迁移数（７１．３０±７．６８）明显少于未转染组（１１９．４０±８．３８）和空载体转染组（１１１．４１±１２．ｓ６），转染组与两对照组迁移力的差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。

结论外源性ＣＢＰ基因稳定转染可抑制人肺腺癌ＳＰＣ．Ａ１细胞的恶性表型，町能通过对Ｓｒｃ家族激酶（ＳＦＫｓ）的负反馈调节抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭。

【关键词】肺腺癌；基因转染；侵袭ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｃＤＮＡ３．０．ＣＢＰｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎｌｕｎｇａｄｅｎｃａｒｃｉｎｏ－ｎｌａｅｅｌｌｌｉｎｅＳＰＣ．ＡｌｚＪＦ，Ｄ￡，Ｄｏｎｇ，ＷＥ＇／Ｗａｎ．ｓｈｅｎｇ，ＳＵＹｕｎ一膨，ｌｇ，ｅｔａ１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃｉｃＳｕｒｇｅｒｙ．ＳｅｃｏｎｄＨｏｓｐｉｔａｌｏ厂ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。

成纤维细胞生长因子受体fgfr1真核表达质粒的构建及其在hek293t细胞的表达

［关键词］ FGFR1；HEK293T 细胞；表达；Western blot；免疫荧光［中图分类号］ R34 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 2095－610X （2020） 02－0016－05
Amplification of Human FGFR1 Gene and Its High-level Expression in HEK293T Cells
JIN Jin-Hua ，LI Ke-yan，ZHANG Ling，WANG Yu-hui，DENG Xiao-ming （Dept. of A nesthesiology，Plastic Surgery Hospital，Chinese A cademy of Medical Sciences and Peking Union
Medical College，Beijing 100144，China）
［Abstract］ Objective To establish an efficient FGFR1 expression system. Methods Human FGFR1 cDNA was amplified by RT-PCR and then inserted into pcDNA3.1 expression vector to construct the pcDNA3.1-FGFR1 recombinant plasmid. The pcDNA3.1-FGFR1 plasmids were transfected into HEK293T cells and the expressed FGFR1 protein was detected by Western blot and Immunofluorescence. Results The results showed that the sequence of FGFR1 cDNA amplified was consistent with that previously reported. The highly efficient expression of FGFR1 in HEK293T cells was achieved after transfection. Conclusion Human FGFR1 cDNA was amplified and the high-level expression of FGFR1 in HEK293T ce lls was achieved.

pcDNA3.1(+)-SjP14纳米微球核酸疫苗对血吸虫致小鼠肝脏损伤的保护作用

pcDNA3.1(+)-SjP14纳米微球核酸疫苗对血吸虫致小鼠肝脏损伤的保护作用杨治河;姚勇;汪学龙【摘要】目的:探究日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白(SjP14)纳米微球核酸疫苗对血吸虫致肝脏损伤的保护作用.方法:30只BALB/c小鼠随机分为生理盐水组、pcDNA3.1(+)-SjP14组和纳米微球核酸疫苗组,每组10只,各组小鼠分别经股四头肌注射生理盐水、重组质粒pcDNA3.1(+)-SjP14及纳米微球核酸疫苗各100μg,每2周免疫一次,共3次.末次免疫后2w,血吸虫尾蚴攻击小鼠,6w后剖杀小鼠,应用HE染色法观察肝脏形态结构的病理变化,同时计数小鼠肝脏虫卵数,并计算单个虫卵肉芽肿的直径、面积和体积.结果:大体形态观察和组织切片均显示生理盐水组小鼠肝脏损害程度最重,纳米微球核酸疫苗组小鼠肝脏损害程度最轻;纳米微球核酸疫苗组小鼠虫卵数、单卵肉芽肿平均直径、面积和体积均明显低于生理盐水组和pcDNA3.1(+)-SjP14组(P<0.05).结论:pcDNA3.1(+)-SjP14-纳米微球核酸疫苗对血吸虫感染小鼠肝脏具有一定的保护作用.【期刊名称】《承德医学院学报》【年(卷),期】2017(034)001【总页数】3页(P1-3)【关键词】日本血吸虫;核酸疫苗;SjP14基因;肝脏保护【作者】杨治河;姚勇;汪学龙【作者单位】滁州城市职业学院解剖学教研室,安徽滁州 239000;安徽医科大学病原生物学教研室;安徽医科大学病原生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】R383.2结论：pcDNA3.1(+)-SjP14-纳米微球核酸疫苗对血吸虫感染小鼠肝脏具有一定的保护作用。

血吸虫病是一种对人类健康危害性较大的寄生虫病，广泛流行于世界各地。

血吸虫在宿主体内能诱导产生保护性免疫反应，但血吸虫只能在终宿主体内发育而不能够进行繁殖，因此减低感染后成虫的负荷能显著减轻宿主肝脏的病理损害和减少血吸虫病的传播，为研制血吸虫病疫苗提供了理论依据[1]。

真核表达载体pcDNA3.1—Beclin1的构建及其对子宫内膜癌HEC细胞增殖的影响

真核表达载体pcDNA3.1—Beclin1的构建及其对子宫内膜癌HEC细胞增殖的影响目的：构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，检测人子宫内膜癌HEC细胞转染pcDNA3.1-Beclin1后，外源性基因Beclin1在蛋白水平的表达，并观察其对HEC细胞增殖的影响。

方法：通过RT-PCR和T/A克隆等方法，构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，并通过脂质体介导的方法将外源性Beclin1基因导入人类子宫内膜癌细胞株HEC中，通过实时PCR检测转染后Beclin1在HEC中表达的情况，并设立实验组（转染pcDNA3.1-Beclin1真核载体）、空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、空白脂质体对照组，用Western blot法检测子宫内膜癌HEC细胞中Beclin1的表达情况，MTT法检测Beclin1对HEC细胞体外生长的影响等，研究Beclin1基因与子宫内膜癌的关系。

结果：经限制性内切酶鉴定及测序，证明Beclin1基因真核质粒的序列完全正确，将其转染HEC细胞，转染后的HEC细胞在体外能继续增殖，但增殖能力明显下降。

结论：Beclin1基因pcDNA3.1-Beclin1真核表达载体构建成功，并能在HEC细胞中表达，转染HEC细胞体外增殖能力明显降低，Beclin1基因用于子宫内膜癌基因治疗具有重要靶向价值。

标签：Beclin1；真核表达载体；细胞；增殖子宫内膜癌（EC）是仅次于乳腺癌和宫颈癌的常见女性生殖系统恶性肿瘤，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%～30%[1]。

其发病率每年10万人约有24.6人，在我国近二十年来也呈逐年上升趋势，但其发生、发展机理仍不十分明确。

多数学者认为其发生发展与雌激素水平密切相关[2]。

长期无拮抗的雌激素刺激可能是主要发病因素，在实验动物中可观察到雌激素引起子宫内膜有丝分裂增多的现象。

pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定

pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定刘培;曹毅;陈微;刘改荣;杨晓红;陶茂灿;罗宏宾【摘要】[目的]从人角质形成细胞系HaCaT中克隆NRP1(Neuropilin-1)基因全长cDNA,构建含NRP1基因的重组真核表达载体,为下一步的NRP1基因功能研究奠定基础.[方法]采用RT-PCR法从人角质形成细胞系HaCaT中扩增NRP1基因全长cDNA,扩增产物通过TA克隆连接到pMD18-T载体进行测序鉴定,然后通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),最后得到pcDNA3.1(+)-NRP1重组质粒.[结果]成功克隆NRP1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1(+)-NRP1 真核表达载体.[结论]pcDNA3A(+)-NRP1 真核表达载体的成功构建可以为NRP1基因功能的进一步研究及其临床基因治疗奠定实验基础.%[Objective] To clone full-length cDNA of Neuropilin-1(NRP1) gene from Human Keratinocytes Cell line (HaCaT) and construct reco-mbinant cukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)-NRP1, and pave the road for deeply research on functions of NRP1. [Methods] The full-length cDNA of NRP1 was amplified from HaCaT cells by RT-PCR and then cloned into pMD18-T vector through TA base pairing. After identification by DNA sequencing, the plasmid pMD18 -T -NRP1 was digested by restriction enzymes and the full -length cDNA of NRP1 was generated and cloned into the eukaryon'c expression vector pcDNA3.1(+), then the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-NRP1 was constructed. [Results] The full- length cDNA of NRP1 was successfully cloned, and the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+)-NRP1 was successfully contracted. [Conclusion] The eukaryoac expression plasmid pcDNA3.1 (+)-NRPl has been constructedsuccessfully, which lays the foundation for further studies of biological functions and clinical gene therapy of NRP1.【期刊名称】《浙江中医药大学学报》【年(卷),期】2012(036)004【总页数】5页(P407-410,421)【关键词】HaCaT细胞;NRP1;真核表达载体【作者】刘培;曹毅;陈微;刘改荣;杨晓红;陶茂灿;罗宏宾【作者单位】浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006【正文语种】中文【中图分类】R331神经纤维蛋白（Neuropilin-1，NRP1）是 1995年[1]发现的一个大小约140 kDa的跨膜蛋白受体，在大部分组织中均有表达。

核酸疫苗pcdna3.1-eg95的构建及在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达

( 1 Co llege of Life Science, InnerM ongo lia University, T he K ey Laboratory of M amm alR eproductiveB iology and Biotechno logy, M inistry of Education, H ohhot 010021; 2O rdos Vocation College, O rdos 017200)
1 材料和方法
1 1 细胞系及培养条件绵羊胎儿成纤维细胞系为本实验室保存, 经原代
培养, 建系后继代培养, 使用 P2 P10代细胞。细胞培养用 DMEM / F12培养基 ( G ibco), 加入 10% 的 FBS (杭州四季青 )和 100 un its/mL 的青霉素, 100 mg /mL 的链霉素 ( S igm a )。饲养条件: 37 , 饱和湿度, 5% CO2。 1 2 细粒棘球蚴原头蚴采集
பைடு நூலகம்关键词: 细粒棘球蚴 EG 95基因核酸疫苗
Construction of Nucleic A cid Vaccine of EG95 and Expression in Sheep Fetal Fibroblasts
Y ang Jiaofu1 W ang Zh igang1 G ao L ian shan2 H ao H u ifang1 L i Zh iw ei1 L i J ie1 Zh an Ku i1
K ey w ords: Echinococcus granulosus EG 95 gene Nuc le ic acid vacc ine
细粒棘球蚴病 ( echinooocoosis) 又称囊型包虫病 ( cystic echinooocoosis, CE ), 呈全球性分布 [ 1] , 在我国北方牧区和半牧区均有流行 [ 2, 3] , 是严重危害中

真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B的改构与应用

ｂｔｅｎＮｔａｄＨｎｌｉｈｕｔｌｃｎｉｆｐＤＡ．，，ｈｓ一ＢｗｓｒｌｅｙｔｅｐｏｕｔｙｅｅｏｎｉｄｌｎｔｅｍｌｐｅｌｅｓｅｏｃＮ３１ｎｃｉ（）ａｅａｄｂｒｄｃｗＩｌｉｏｔ一，～ｐｃｈ．Ｂ
胞后，Ｈｉ标签抗体验证其表达。结果：序结果证实已将预想的序列替换至ｐＤＡ．ｍｃｈｓ一Ｂ的多克隆位用ｓ测ｃＮ３１ｙ — ｉ）一（点中相应位置，构为质粒ｐＤＡ．（）ｃｎｔｃ；用改构的真核表达载体表达了相应的目的基因。结论：改ｃＮ３１一ｒｏｓｕｔ利ｅｒ改构的真核表达载体ｐＤＡ．（）ｃｎｔｃ可以简化融合ｍｃ和Ｈｓ签的目的基因克隆的过程，且增加了限制性ｃＮ３１一ｒｏｓｕｔｅｒｙｉ标并
好的２条寡核苷酸链互相退火，换ｐＤＡ３１ｍｃｈｓ一Ｂ的多克隆位点中Ｎｔ替ｃＮ．一ｙ— ｉ（）ｏＨｉｄ１间的部分；用改构Ｉ与ｎ１１利的真核表达载体，别构建亲环蛋白Ａ、绿素还原酶Ｂ和过氧化氢酶基因的重组真核表达载体，时转染２３分胆瞬９Ｔ细
ｃｏｉｇｏａｇｔｅｅｌｎｎｆｔｒｅｇｎ．Ｍｅｈｄ：Ｔｅｉｎｄｏｉｏｕｌｏｉｅｒｎｅｌｇｅｃｔｅ，ａｄｔｅＤＮＡｆａｍｅｔｔｏｓｗｏｄｓｅｌｎｃｅｔｓｗｅｅａｎａｉａｈｏｈｒｎｈｇｇｄｎｒｇｎ

pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP真核表达质粒构建

浙江大学学报（医学版）第４０卷达质粒签定结果ＢａｍＨＩ内切酶酶切，Ｉ％琼脂糖凝胶电泳，如图ｌ所示，得到７１６ｂｐ、６３０９ｂｐ条带，为正确克隆。

图１ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＣＹＰｌ９（１５６３ｂｐ）ＢａｍＨＩ酶切鉴定Ｆｉｇ．１ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＣＹＰｌ９（１５６３ｂｐ）２．２ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＣＹＰｌ９一ＧＦＰ重组质粒鉴定结果经Ｈｉｎｄ９Ｉ和ＣｌａＩ酶切鉴定，ｌ％琼脂糖凝胶电泳，如图２所示，得到６５２６ｂｐ、ｌ１９６ｂｐ条带，测序验证。

图２ｐｅＤＮＡ３．１（＋）－ＣＹＰｌ９一ＧＦＰ重组质粒ＨｉｎｄⅢ和ＣｌａＩ酶切鉴定Ｆｉｇ．２ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｅｌｅａｓｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ３．１（＋）・ＣＹＰＩ９．ＧＦＰ２．３ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＣＹＰｌ９ｗ３９Ｒ＿ＧＦＰ和ｐｅＤＮＡ３．１（＋）一ＣＹＰｌ９粼．ＧＦＰ以及ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＣＹＰｌ９Ｗ３９昏嗍Ｃ＿ＧＦＰ真核表达质粒经测序结果ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＣＹＰｌ９Ｗ３９Ｒ＿ＧＦＰ质粒ＣＹＰｌ９基因第３９位密码子ＴＧＧ由ＣＧＧ所替代，ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ｃＹＰｌ９‘幽Ｃ＿ＧＦＰ质粒ＣＹＰｌ９基因第２６４位密码子ＣＧＣ由ＴＧＣ所替代，而ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＣＹＰｌ９ｗ３卟。

嗍Ｃ＿ＧＦＰ质粒ＣＹＰｌ９基因第３９位密码子ＴＧＧ、第２６４位密码子ＣＧＣ分别由ＣＧＧ和ＴＧｃ替代。

２．４野生犁ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＣＹＰｌ９一ＧＦＰ质粒在细胞中表达情况观察分别以明视野图片为对照，在经转染质粒的ＭＣＦ－７和Ｂｃａｐ－３７细胞中均能观察到较强的绿色荧光，如图３—６所示。

３讨论ＣＹＰｌ９基因所编码的Ｐ４５０ａｒｏｍ是雄激素转化为雌激素的限速酶和关键酶，该基因单核苷酸多态性能使其编码的芳香化酶蛋白结构和活性发牛改变，从而可能影响乳腺癌内分泌治疗的疗效。

pcDNA3.1(+)-NPM1真核表达质粒构建

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅＥｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｓｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＮＰＭ１，ｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｅｃｔ
ｈｕｍａｎｂｌａｄｄｅｒｃａｎｃｅｒｐｕｍｃ一９１ｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．ａｎｄｏｂｓｅｒｖｅｉｔｓｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
核仁磷蛋白１（ＮＰＭ１），即Ｂ２３，是细胞核颗粒聚集区内高表达的一种非核糖体核仁磷酸化蛋白，分子量为３７ＫＤ… 。它是一种多功能蛋白，参与细胞增殖与分化、Ｐ５３调节等多种生物过程４。先前的研
究证明Ｎｐｍｌ不仅在多种肿瘤中表达增高，在胃癌、白血病等耐药细胞系中也呈高表达。在本实验室先前的实验中，也发现ｎｐｍｌ在膀胱移行上皮细胞癌阿霉素耐药系ｐｕｍｃ一９１／ＡＤＭ细胞系中表达上调。
５６０
ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆
ＣｌｉｎＭｅｄ，Ａｐｒ．２０１８，Ｖｏ１．２５，
Ｎｏ．４
· 基础研究 ·
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＮＰＭ１真核表达质粒构建
孟倩，雷婷，张曼（首都医科大学附属北ｂｉｎａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＲｅｃｏｍｂｉｎｅｄｐｌａｓｍｉｄｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｗｉｔｈｂａｃｔｅｒｉａｌＰＣＲａｎｄｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．
ＴｈｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＮＰＭ１ｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｐｕｍｃ一９１ｃｅｌｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓ

真核表达载体pcDNA3.1(+)—MyoD—HA—His的构建及功能检测

真核表达载体pcDNA3.1（+）—MyoD—HA—His的构建及功能检测作者：杜朝等来源：《河北科技大学学报》2014年第02期文章编号：10081542（2014）02014905doi：10.7535/hbkd.2014yx02007摘要：为了便于检测和纯化转染到非肌肉细胞的生肌因子MyoD，同时为能够与转染的其他生肌因子的表达量进行比较，将MyoD编码区克隆在真核表达载体pcDNA3.1（+）HAHis。

测序表明克隆的MyoD序列正确，并与标签序列构成一个开放阅读框；Western blot显示在起始密码子前添加kozak序列GCCGCCACC，可使融合蛋白能够以较高水平表达；生肌转化实验表明，融合蛋白MyoDHA能够有效激活靶基因的表达。

关键词：表达载体；标签；MyoD中图分类号：Q753 文献标志码：AAbstract：In order to conveniently detect and purify the myogenic factor MyoD exoexpressed in the nonmuscle cells， and to compare with the expression level of other myogenic factors cotransfected with MyoD， the coding sequence （CDS） of MyoD was cloned and inserted into pcDNA3.1（+）HAHis， an eukarytic expression vector. Sequencing result confirms that the insert is correct and forms the same ORF with the HA and its sequences. Furthermore， Western blot shows that the fusion protein MyoDHA expresses with a high level for the addition of kozak sequence GCCGCCACC，and myogenic conversion demonstrates the fusion protein MyoDHA can activate the target genes effectively.Key words： expression vector； tag； MyoD生肌作用（myogenesis）是指多能干细胞经过定向和分化，成为肌细胞，肌细胞之间相互融合为肌管，形成肌纤维的过程。

pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体的构建

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ＡＫＲ１０ｅｋｒｏｉｘｒｓｉｎｖｃｏｓｓｃｓｆｌｏｓｒｃｅｕａｙｔｃｅｐｅｓｏｅｔｒｗａｕｃｅｓｕｌｃｎｔｔｄ．Ｂ１ｙｕＫｅｏｄｓ：ｙｗｒＡＫＲ１０；ｃＢ１ｐＤＮＡ．１；ｋｒｏｉｘｒｓｉｎｖｃｏ３ＥｕａｙｔＣｅｐｅｓｏｅｔｒ
医结合影像学杂志，０５，（）１１１３２０３３：８．８．
２０１（）１２１３０７，８２：５ —５．
［Ｏ马海峰，１］王
填塞瘘管造影三维重组技术临床应用探讨［］临床放射学杂志，Ｊ．
２０，６６：０－８０７２（）６５０．６
洗脱液应保证其ｐ值在７０— ．Ｈ．８５范围内（以用可
体大多数组织中并不表达，但在人类肝癌、非小细胞肺癌等肿瘤中高表达ＪＫ１。ＡＲ１０高效催化还原脂肪Ｂ醛和芳香醛，与抗肿瘤药物和快速生长癌细胞自身参
相信随着ＭＳＴ的出现和软件不断的升级，旋Ｃ螺
ＣＴ三维重建技术会给肛瘘的诊断提供更丰富、有推更
［１郭献忠，１］兰莉王，宏清丁，多层螺旋Ｃ等．Ｔ三维重建技术在复杂肛瘘中的应用［］浙江医学，０８３（）４７４９Ｊ．２０，０４：０－．０［２丁义江．１］高位复杂性肛瘘的诊治进展［］大肠肛门病外科杂志，Ｊ．
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