(2008)pcDNA3_hNGFb真核表达载体的构建及其表达

・学术交流・pcDNA3-hN GFb真核表达载体的构建及其表达

邓兴力　杨智勇　董坚　王廷华　徐丹　冯忠堂

【摘要】　目的　构建人神经生长因子β(N GF-β)基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表

达。方法　以R T-PCR从人脑组织总RNA中扩增N GF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD2

NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和

western blot鉴定N GF-β在细胞内的表达。结果　R T-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒

pcDNA3-hN GFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人

N GF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明N GF-β及其

前体proN GF-β能在真核细胞中正确表达。结论　成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hN GFb,

为后续的研究奠定基础。

【关键词】　神经生长因子;　真核表达;　重组质粒;　转染

C onstru ction o f recombinant plasmid pcDN A32hNG Fb and its exp ression　DEN G Xing2li,Yang Zhi2yong,

DO N G J ian,et al.　De partment of N eurosurgery,1st A f f iliated Hos pital of Kunming Medical

College,Kunming650032,China

【Abstract】　Objective　To construct the eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3-

hN GFb and investigate its expression in L929cells.Methods　The cDNA of human nerve growth factor

beta subunit(N GF-β)was amplified by R T-PCR from human brain tissue.By gene recombination

technique,human N GF-βcDNA was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.The recombi2

nant plasmid was verified with restriction enzyme digestion and DNA sequencing.Transfected the recom2

binant vector into L929cells with Lipofectamine2000transfection reagent.The expression of N GF-β

was analyzed by immunocytochemistery as well as western blot.R esults　The R T-PCR product is

750bp specific segment.By restriction enzyme digestion,the recombinant plasmid was digested into

750bp and5.2kb f ragments.DNA sequence result showed the750bp f ragment was identical with human

N GF-βcDNA in GenBank.Immunocytochemistery and western blot showed the N GF-βwas expressed

successfully in L929cells.Conclusions　The recombinant plasmid pcDNA3-hN GFb was constructed

successfully,which will provide the foundation for f urther research.

【K ey w ords】　Nerve growth factor(N GF);Eukaryotic expression;Recombinant plasmid;T ransfection

中图分类号:R741 文献标识码:A 文章编号:100926574(2008)022*******

神经生长因子(nerve growt h factor,N GF)是神经营养因子家族中最早被发现也是迄今为止研究得最为深入的细胞生长因子。N GF在体内首先以其前体的形式合成,随后在各种蛋白酶的作用下裂解为成熟体[1]。最近研究表明,N GF前体(p roN GF)具有与成熟N GF相反的生物学活性,其通过作用于p75N TR受体及sortilin受体介导包括神经细胞内的多种细胞凋亡[2-5]。本研究将构建人N GF-β基因真核表达质粒pcDNA3-hN GFb,并研究其在L929细胞中的表达情况,为进一步研究p roN GF的

作者单位:650032昆明医学院第一附属医院神经外科(邓兴力,杨志勇),生物治疗中心(董坚);昆明医学院神经科学研究所(王廷华、徐丹、冯忠堂)

作者简介:邓兴力(1979-),男,博士研究生。研究方向:细胞移植治疗帕金森病的研究。

通讯作者:冯忠堂　fzt@ 生物学功能奠定实验基础。

1　材料与方法

1.1　材料　

1.1.1　质粒、细菌与脑组织　真核表达质粒载体pcDNA3由昆明医学院第一附属医院生物治疗研究中心保存;小鼠成纤维细胞系L929、E.coli D H5α由昆明医学院神经科学研究所保存;人脑肿瘤旁组织由昆明医学院第一附属医院神经外科提供。

1.1.2　主要试剂与工具酶　TRIzol,Lipofectamine 2000Reagent,G418,RPM I1640培养基,小牛血清(Invitrogen);Hind,xho,T4DNA Ligase,Calf In2 testine Alkaline Phosp hotase,First Strand cDNA Synt hesis K it,High Fidelity PCR Enzyme Mix(MB I Fermentas);凝胶回收试剂盒,DNA纯化试剂盒,质粒DNA提取试剂盒(OM EGA);DNA MA KER DL2000,DNA MA KERλ-Eco T14(Takara);6×