原核表达载体的重要调控元件
原核表达实验报告 -回复
原核表达实验报告-回复实验目的：本实验旨在探究原核表达的过程和原理，分析原核表达实验的步骤和相关技术应用。
引言：原核表达是生物学领域中常用的实验技术之一，它可以通过转录和翻译过程将外源基因导入到原核细胞中并使其表达出目标蛋白质。
原核表达在基因工程、药物研发、蛋白质生产等方面起着重要作用。
了解原核表达的过程和原理，掌握其实验步骤和技术应用，对于学习和应用相关领域的研究都具有重要意义。
实验步骤：1. 选择合适的原核表达系统：原核表达系统主要包括细菌和酵母两种。
在选择表达系统时，需要考虑目标蛋白质的生理特性和产量需求等因素。
细菌表达系统常用的有大肠杆菌(E. coli) 和拟杆菌(Bacillus subtilis)，而酵母表达系统则常用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
2. 构建表达载体：构建表达载体是原核表达实验的关键一步。
通常采用的是重组DNA技术，将目标基因插入载体中。
载体中包含启动子、选择标记物和阻遏子等元件，以控制和增强目标基因的表达。
3. 转化表达细胞：将构建好的表达载体导入到表达细胞中。
常用的转化方法有化学法、电转化法和热冲击法等。
通过转化，表达载体成功导入到细胞内。
4. 选择和培养表达阳性克隆：转化后的细菌需要进行筛选，得到表达阳性克隆。
通常通过选择标记物（如抗生素）对未转化细胞进行抑制，从而判断转化是否成功。
表达阳性克隆可通过液体培养或固体培养等方式进行扩增。
5. 蛋白质表达和纯化：经过培养扩增的表达阳性克隆可进行蛋白质表达和纯化。
比较常用的方法有亲和层析、离心扩增和玻璃珠破碎等。
实验技术应用：1. 蛋白质生产：原核表达广泛应用于大规模蛋白质生产。
通过原核表达系统，可以高效地表达大量目标蛋白质，满足科研和工业生产的需求。
2. 蛋白质互作研究：原核表达技术可用于研究蛋白质的互作关系。
通过表达不同蛋白质，进行蛋白质相互作用的分析，有助于揭示蛋白质功能和信号转导网络等。
第六章 原核生物表达调控
第一节概述围绕基因表达过程中发生的各种各样的调节方式都通称为基因表达调控（gene regulation或gene control）。
几个基本概念1、顺式作用元件和反式作用因子：基因活性的调控主要通过反式作用因子（通常是蛋白质）与顺式作用元件（通常在DNA 上）相互作用而实现。
顺式作用元件是指对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因；同时，这种DNA序列通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中，如启动子和终止子，都是典型的顺式作用元件。
反式作用因子是能调节与它们接触的基因的表达的各种扩散分子（通常是蛋白质），如RNA聚合酶、转录因子。
2、结构基因和调节基因:结构基因(structural gene)是编码蛋白质或RNA的基因。
细菌的结构基因一般成簇排列，多个结构基因受单一启动子共同控制，使整套基因或都表达或都不表达。
调节基因(regulator gene)是编码合成那些参与其他基因表达调控的RNA或蛋白质的特异DNA 序列。
调节基因编码的调节物质通过与DNA上的特定位点结合控制转录是调控的关键。
比如：它能使结构基因在需要某种酶时就合成某种酶,不需要时,则停止合成，它对不同染色体上的结构基因有调节作用。
调节物与DNA特定位点的相互作用能以正调控的方式（启动或增强基因表达活性）调节靶基因，也能以负调控的方式（关闭或降低基因表达活性）调节靶基因。
DNA位点通常位于受调节基因的上游，但也有例外.3、操纵基因和阻遏蛋白操纵基因(operator)是操纵子中的控制基因，在操纵子上一般与启动子相邻，通常处于开放状态，使RNA聚合酶能够通过并作用于启动子启动转录。
但当它与调节基因所编码的阻遏蛋白结合时，就从开放状态逐渐转变为关闭状态，使转录过程不能发生。
阻遏蛋白(aporepressor)是负调控系统中由调节基因编码的调节蛋白，它本身或与辅阻遏物(corepressor)一起结合于操纵基因，阻遏操纵子结构基因的转录。
原核、真核生物基因及表达调控
原核、真核生物基因及表达调控引言现代生物学中“基因”一词甚为流行，细胞学、遗传学、生物化学等，以及各种生物学课本中，都涉及到“基因”一词。
甚至象典型的宏观生物学科——生态学，也把一片森林称为一个“基因库”[1]。
现代生物学已经完全证明，DNA 分子是由称为核普酸的有机分子线性聚合而成。
基因就是核普酸按一定顺序排列而成的DNA分子片段，它携带着遗传信息。
基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
其实质就是遗传信息的转录和翻译。
在个体生长发育过程中，生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）[2]。
原核生物和真核生物的基因及表达过程有着差异。
随着世界分子生物学研究不断深入，基因表达技术有了很大的提高。
迄今为止，人们已经研究开发出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白[3]。
一．原核、真核生物基因结构原核生物基因分为编码区与非编码区，所谓的编码区就是能转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，非编码区位于编码区的上游及下游。
[4]在调控遗传信息表达的核苷酸序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。
RNA聚合酶是催化DNA转录为RNA，能识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
真核生物基因结构见图1：图1 真核生物基因结构二．原核、真核生物基因结构的区别最主要的在于真核基因是不连续的,而原核基因是连续的。
所谓真核基因的不连续，即一个基因的编码序列也叫外显子，被一个或多个非编码序列，又叫内含子所间隔。
[5]这些内含子和外显子同属一个转录单位，转录形成前体。
经过转录的加工，即切去内含子，重新连按外显子，从而得到成熟。
而绝大多数的原核基因是连续的，没有内含子的间隔，转录产生成熟。
不仅如此，而且凡在代谢途径上功能有关的多个基因可能紧密相联，与它们的调控基因一起组成一个操纵子，转录到一条链。
原核表达调控与色氨酸操纵子
开发高效原核表达系统
继续优化原核表达系统，提高外源基因在原核细 胞中的表达效率和稳定性，降低生产成本，推动 基因工程药物和疫苗的广泛应用。
深入解析代谢途径调控
深入研究色氨酸等代谢途径的调控机制，揭示代 谢物与基因表达的相互作用关系，为代谢工程和 合成生物学提供新的理论和方法。
04
研究方法和实验结果
介绍本研究所采用的研究方法、实验设计和实验结果 ，以及对实验数据的分析和解读。
05
研究意义和展望
总结本研究的意义和贡献，以及对未来研究方向的展 望和建议。
02
原核表达调控概述
原核生物基因表达特点
80%
转录与翻译偶联
原核生物的转录和翻译过程在时 间和空间上紧密偶联，转录未完 成时翻译已经开始。
催化RNA合成的酶，其活性受到多种因子的调控。
其他调控因子
03
如小分子代谢物、环境因素（温度、pH值）等也能影响原核生
物的基因表达。
03
色氨酸操纵子结构与功能
色氨酸操纵子结构组成
阻遏蛋白
结合到操纵基因上，阻止RNA聚合酶的结合 和转录的起始。
结构基因
编码色氨酸生物合成所需的酶。
操纵基因
与阻遏蛋白结合的区域，控制转录的起始。
转化与筛选
将重组质粒转化入宿主细胞， 通过选择性培养基筛选阳性克 隆。
诱导表达
在含有合适诱导剂的培养基中 培养阳性克隆，诱导目标蛋白 的表达。
表达产物检测
通过SDS-PAGE、Western blot等方法检测目标蛋白的表 达情况。
数据收集和处理方法
原核表达技术
原核表达技术原核表达技术是一种基因工程的方法，用于在原核生物（如细菌）中表达外源基因。
它是研究生物学、医学和工业应用的重要工具。
原核表达技术的发展使得我们能够更好地理解基因的功能和调控机制，同时也为蛋白质的生产和应用提供了一种高效可行的方法。
在原核表达技术中，常用的载体是质粒。
质粒是一种环状的DNA分子，能够在细菌中自主复制和表达外源基因。
通过将目标基因插入到质粒的适当位点上，可以利用细菌的表达系统来合成目标蛋白质。
质粒通常包含有启动子、转录终止子、选择性标记基因等功能元件，以便实现基因的高效表达和筛选。
在原核表达技术中，选择适当的宿主菌株也是至关重要的。
常用的宿主菌包括大肠杆菌（E. coli）和酵母菌等。
这些菌株具有良好的生长特性和表达系统，能够提供高效的表达平台。
另外，在选择宿主菌株时还需要考虑到目标蛋白质的特性和表达需求，以确保表达系统的稳定性和产量。
原核表达技术的关键步骤包括基因克隆、转化、筛选、表达和纯化等。
首先，通过PCR等方法将目标基因扩增得到目的片段，并将其插入到质粒的适当位点上。
然后，将重组质粒导入宿主菌株中，使其发生转化。
接下来，通过选择性培养基或标记基因进行筛选，以得到含有目标基因的菌落。
随后，利用诱导剂等方法激活表达系统，使目标蛋白质开始合成。
最后，通过离心、柱层析等手段对目标蛋白质进行纯化和分析，以得到纯度较高的产物。
原核表达技术具有许多优势。
首先，宿主菌株的生长速度快，表达系统稳定，能够提供高产量的蛋白质。
其次，原核表达系统相对简单，易于操作和优化。
此外，原核表达技术还可以用于蛋白质的定点突变、标记和修饰等研究，为蛋白质工程和功能研究提供了重要手段。
然而，原核表达技术也存在一些限制。
首先，由于原核生物的不同表达机制和翻译机器，某些复杂的蛋白质可能无法在原核系统中正确折叠和修饰。
其次，质粒的稳定性和复制效率可能受到限制，影响表达产量。
此外，一些蛋白质可能具有毒性，对细菌的生长和表达产生负面影响。
第14章 原核生物基因表达调控
第14章原核生物基因的表达调控重点：操纵子的结构特点和功能；乳糖操纵子的正负调控；色氨酸操纵子的衰减作用。
难点：色氨酸操纵子的衰减作用。
第一节基因调控的基本定律一、基因调控水平二、基因和调控元件三、DNA结合蛋白一、基因调控水平基因表达的调控可以发生在DNA到蛋白质的任意节点上，如基因结构、转录、mRNA 加工、RNA的稳定性、翻译和翻译后修饰。
二、基因和调控元件基因：是指能转录成RNA的DNA序列。
结构基因：编码代谢、生物合成和细胞结构的蛋白质。
调节基因：产物是RNA或蛋白质，控制结构基因的表达。
其产物通常是DNA结合蛋白。
调控元件：不能转录但是能够调控基因表达的DNA序列。
三、DNA结合蛋白调控蛋白通常含有与DNA结合的结构域，一般由60-90个氨基酸组成。
在一个结构域中，只有少数氨基酸与DNA接触。
这些氨基酸（包括天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸和精氨酸）常与碱基形成氢键，或者与磷酸核糖骨架结合。
根据DNA结合结构域内的模体，可以将DNA结合分成几种类型（图16.2）。
第二节大肠杆菌的乳糖操纵子一、操纵子结构二、正负调控三、乳糖操纵子四、lac突变五、正控制一、操纵子结构原核和真核生物基因调控的主要差异在于功能相关的基因的组成。
细菌的功能相关的基因常常排列在一起，并且由同一启动子控制。
一群一起转录的细菌的结构基因（包括其启动子和控制转录的额外序列）称为操纵子。
二、正负调控转录水平上的调控主要有两种类型：负调控：gene ON 阻遏蛋白 OFF正调控：gene OFF 激活蛋白 ON诱导：活性阻遏蛋白 失活诱导因子＋非活性激活蛋白 活性阻遏：失活阻遏蛋白 活性共阻遏蛋白＋活性激活蛋白 失活三、乳糖操纵子乳糖操纵子是诱导型操纵子，当诱导物不存在时，阻遏蛋白结合到操纵序列上并阻止转录；当诱导物存在时，阻遏蛋白与诱导物结合后失去活性，转录才得以进行。
四、lac突变为了鉴定乳糖操纵子各个成分的功能，Jacob和Monod做了细菌的接合实验，其中供体菌的F’因子上也带有乳糖操纵子。
原核生物基因表达调控概述
原核生物基因表达调控概述基因表达调控是生物体内基因表达调节控制机制，使细胞中基因表达的过程在时间，空间上处于有序状态，并对环境条件的变化做出适当的反应复杂过程。
1.基因表达调控意义在生命活动中并不是所有的基因都同时表达，代谢过程中所需各种酶和蛋白质基因以及构成细胞化学成分的各种编码基因，正常情况下是经常表达的，而与生物发育过程有关的基因则需在特定的时空才表达，还有许多基因被暂时的或永久的关闭而不来表达。
2.原核基因表达调控特点原核生物基因表达调控存在于转录和翻译的起始、延伸和终止的每一步骤中。
这种调控多以操纵子为单位进行，将功能相关的基因组织在一起，同时开启或关闭基因表达即经济又有效，保证其生命活动的需要。
调控主要发生在转录水平，有正、负调控两种机制在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA的结构，RNA 聚合酶的功能、蛋白质因子及其他小分子配基的相互作用。
细菌的转录和翻译过程几乎在同一时间内相互偶联。
细胞要控制各种蛋白质在不同时期的表达水平，有两条途径：（1）细胞控制从其DNA模板上转录其特异的mRNA的速度，这是一条经济的途径，可减少从mRNA合成蛋白质的小分子物质消耗，这是生物长期进化过程中自然选择的结果，这种控制称为转录水平调控。
（2）在mRNA合成后，控制从mRNA翻译肽链速度，包括一些与翻译有关的酶及其复合体分子缔合的装配速度等过程。
这种蛋白质合成及其基因表达的控制称为翻译水平的调控。
二.原核生物表达调控的概念（1）细菌细胞对营养的适应细菌必须能够广泛适应变化的环境条件。
这些条件包括营养、水分、溶液浓度、温度，pH等。
而这些条件须通过细胞内的各种生化反应途径，为细胞生长的繁荣提供能量和构建细胞组分所需的小分子化合物。
（2）顺式作用元件和反式作用元件基因活性的调节主要通过反式作用因子与顺式作用元件的相互作用而实现。
反式作用因子的编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列在同一个DNA分子上。
RNA聚合酶是典型的反式作用因子。
分子第五章原核基因表达调控
CAP正调控 + + + + 转录
DNA
CAP P O Z Y A
CAP CAP CAP CAP 无葡萄糖，cAMP浓度高时 促进转录
CAP
有葡萄糖，cAMP浓度低时
2、影响因子
（5）cAMP与代谢物激活蛋白 ◇ cAMP的浓度受到葡萄糖代谢的调节。 ◇由Crp基因编码的代谢物激活蛋白（CAP）能与cAMP形成复合物。 ◇ cAMP—CAP复合物是激活lac的重要组成部分，这与阻遏体系无 关，细菌对它的需要是独立的。转录必须有cAMP—CAP复合物结合 在启动子区。
Abstract
◇基因表达调控主要表现在以下两个方面： 1、转录水平上的调控(transcriptional regulation)。 2、转录后水平上的调控(post-transcriptional regulation)： mRNA加工成熟水平上的调控、翻译水平上的调控 。
一、基本概念
1、组成蛋白和调节蛋白 ◇组成蛋白：细胞内有许多种蛋白质的数量几乎不受外界环境 的影响，这些蛋白质称为组成蛋白。 ◇调节蛋白：是一类特殊的蛋白质，它们可以影响一种或多种 基因的表达。调节蛋白包括：正调节蛋白和负调节蛋白。前者 是激活蛋白，后者是阻遏蛋白。
激活蛋白
启动子 操纵子
负调控
阻遏蛋白
启动子 操纵子
正调控和负调控
一、基本概念
5、操纵基因和操纵子 ◇操纵基因(operator)：也叫操作子，是操纵子中的控制基因，在 操纵子上一般与启动子相邻，通常处于开放状态，使RNA聚合酶 通过并作用于启动子启动转录。 ◇操纵子(operon)：由操纵基因以及相邻的若干结构基因所组成 的功能单位，其中结构基因转录受操纵基因控制。
5-2 原核生物基因表达调控的机制
3/2/2018
17
乳糖操纵子中CAP的正性调节
转录活性提高50倍
DNA
CAP P O Z Y A
CAP CAP CAP CAP 无葡萄糖，cAMP浓度高时
CAP
有葡萄糖，cAMP浓度低时
18
阻遏蛋白与 cAMP-CAP 对乳糖操纵子 转录的调控
19
※单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源； 若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时， 细菌首先利用葡萄糖。
阻遏蛋白
有葡萄糖存在 没有乳糖存在
DNA
I
mRNA
阻遏蛋白
pol O Z Y A
启动转录 β-半乳糖苷酶
半乳糖
乳糖
没有葡萄糖存在 有乳糖存在
DNA
I
mRNA
阻遏蛋白
P O Z Y A pol
启动转录
mRNA
β-半乳糖苷酶
半乳糖
乳糖
没有葡萄糖存在 有乳糖存在
-10
+1
+10
+20
+30
.
.
.
.
.
※葡萄糖对lac 操纵子的阻遏作用称分解代 谢阻遏。
20
7
乳操纵子的结构
调控区
结构基因
P OZ YA
DNA
阻遏基因 I
操纵元件 启动子
CAP结合位点
Z：β-半乳糖苷酶 Y：透酶 A：乙酰基转移酶
8
阻遏蛋白的负性调节
阻遏基因
DNA
I
P OZ Y A
mRNA
阻遏蛋白
有葡萄糖存在 没有乳糖存在
阻遏蛋白的负性调节
阻遏基因
原核表达载体的重要调控元件(启动子、SD序列与终止子)
原核表达载体的重要调控元件（启动子、SD序列与终止子）1．启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。
没有启动子，基因就不能转录。
由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。
原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。
在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。
来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。
在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。
转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。
-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。
原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp (色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。
（1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。
Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。
正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。
负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。
乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。
分子生物学课后习题答案
第一章绪论☐DNA重组技术和基因工程技术。
DNA重组技术又称基因工程技术，目的是将不同DNA片段（基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，而限制性内切酶DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。
DNA重组技术有着广泛的应用前景。
首先，DNA重组技术可以用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽，如激素、抗生素、酶类及抗体，提高产量，降低成本。
其次，DNA重组技术可以用于定向改造某些生物的基因结构，使他们所具有的特殊经济价值或功能成百上千倍的提高。
☐请简述现代分子生物学的研究内容。
1、DNA重组技术(基因工程)2、基因表达调控(核酸生物学)3、生物大分子结构功能(结构分子生物学)4、基因组、功能基因组与生物信息学研究第二章遗传的物质基础及基因与基因组结构☐核小体、DNA的半保留复制、转座子。
核小体是染色质的基本结构单位。
是由H2A、H2B、H3、H4各两分子生成八聚体和由大约200bp的DNA构成的。
核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一步。
DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。
这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。
因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。
转座子是存在染色体DNA上的可自主复制和移位的基本单位。
转座子分为两大类：插入序列和复合型转座子。
☐DNA的一、二、三级结构特征。
DNA的一级结构是指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。
DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。
分为左手螺旋和右手螺旋。
DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。
3-1.操纵子-原核基因表达调控
• N-end arm of helix reach around to other face (to minor groove)
Hug
l trans-Factor的二聚体或四聚体以对称的方式结合 cis-Factor 表现一种“二重对称性”
dimer as Right Shoes model binding with palindromic Seq. in major groove
IS/I+
iS > I+ iS > iC
等位基因间的显隐关系
I+
OC
Z
Y
A
mRNA
OC失去与阻遏物 特异结合的能力
乳糖
mRNA
I+
O+
等位基因间的显隐关系
OC ＞ O+
cis-dominant
（顺式显性）cis-dominant
The ability of a site (cis-factor) to control adjacent gene irrespective of the presence in the cell of other alleles of the site.
激活RNA 聚合酶启动
•正控制—诱导型操纵子 (多为分解酶类)
w.t. (I+O+P+) 诱导型
iS mut. 超阻突变 (super-repression) 诱导物 不能被激活因子活化
operon 关闭
I+ > iS
e.g. cAMP control (一种通用的控制系统)
E.coli
Glucose Lactose
原核生物基因表达调控
20
同位素示踪实验
把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸,但没 有半乳糖诱导物的培养基中繁殖几代然后再将这些带有 放射活性的细菌转移到不含35S、无放射性的培养基中 随着培养基中诱导物的加入, β-半乳糖苷酶便开始合成。 分离β-半乳糖苷酶, 发现这种酶无35S标记说明酶的合 成不是由前体转化而来的, 而是加入诱导物后新合成的。
• Jacob和Monod认为诱导酶（他们当时称为适应酶）
现象是个基因调控问题, 可以用实验方法进行研究, 因此
选为突破口, 终于通过大量实验及分析, 于1961年建立
了该操纵子的控制模型。
-
21
酶的诱导
-
22
• 酶的诱导现象是生物进化过程中出现的一种合理、 经济地利用有限资源的本能。
• 酶诱导已证明是低等生物的普遍现象。
倒位片段
鼠伤寒沙门菌鞭毛素基- 因的调节
H1鞭毛素
10
鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimrium）的相转变（phase variation）
-
11
2.σ 因子对原核生物转录起始的调控
σ因子:原核生物RNA聚合酶的一个亚基，是转录起 始所必需的因子，主要影响RNA聚合酶对转录起始 位点的正确识别，这种σ因子称σ70,此外还有分子量 不同,功能不同的其他σ因子 。
ＰＯ
操纵子可视为原核生物的转录单位，它可以逐个
地从原核生物基因组中分离出来，对其结构功
能加以研究。
-
15
3.乳糖操纵子
1) 乳糖操纵子的结构
启动子 操纵基因
调节蛋白
（阻遏蛋白）
-
结构基因
16
3个编码的结构基因
• Z编码β-半乳糖苷酶: 将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，还能 将乳糖转变为异构乳糖
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间： 2019-06-03 新闻来源：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
2、PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
原核蛋白表达 问题解析
原核蛋白表达问题解析
原核蛋白表达是一种人工实验技术，用于在原核生物（如细菌）中表达特定的
蛋白质。
它是研究生物学、药物开发和生物工程领域中常用的工具之一。
在原核蛋白表达中，研究者通常通过将目标基因转移到表达载体中来实现蛋白
表达。
表达载体是一种特殊的DNA分子，其中包含目标基因的编码序列和其他必
要的调控元件。
通过将表达载体导入到适合的宿主细胞中，目标基因可以被转录和翻译为蛋白质。
原核蛋白表达有许多优点，其中包括高表达水平、简单和经济等。
原核生物的
生长速度通常很快，所以可以在短时间内大量表达目标蛋白质。
此外，原核蛋白表达体系相对较简单，无需特殊的培养条件或复杂的培养基，这降低了实验的成本和难度。
然而，原核蛋白表达也存在一些挑战和限制。
由于原核生物的细胞环境与真核
生物不同，某些复杂的蛋白质可能无法正确地折叠或修饰。
此外，某些蛋白质可能对原核表达系统的毒性有较高的敏感性，从而降低了表达效率。
为了克服这些问题，研究者通常采用各种策略来优化原核蛋白表达。
例如，他
们可以通过优化转化条件、选择适当的宿主细胞或使用辅助蛋白质来提高表达效率。
此外，关于蛋白质折叠和修饰的研究也可以提供有价值的信息。
在总结一下，原核蛋白表达是一项重要的实验技术，可用于快速高效地表达目
标蛋白质。
尽管存在一些挑战，但通过优化实验条件和相关研究的进行，原核蛋白表达仍然是生物学和生物工程领域中广泛使用的工具之一。
原核生物的转录及调控
★ RNApol-attaching factor
★ After initiation→ substituting σ → NusA + core E
★ Impel RNApol. pausing in terminator for 1’-15’ and
waiting for Rho factor to stop transcription of RNA
序列。
一、基因的编码链和有意义链
• 模板链：用于转录RNA的链称为模板链，或
负（－）链，又称无义链。
• 编码链：与模板链互补的DNA链称为编码链，
或正（＋）链，又称有义链。
二、转录的基本要点
• 底物：NTP；
• 模板：反义链；
• 方向：5’→3’ ；
• 酶：RNA pol ； • 产物：RNA单链
-10 upstream +1 start point +10 downstream
一、转录的起始
• 关键：全酶能以很高的亲和性结合在启
动子promoter ； • 启动子：RNA聚合酶识别、结合并起始 转录的一段DNA序列。
（一）原核启动子的结构 promoter 由两个重要部分组成
● -70 ~ -40 ：up element（上游元件）
-35 (R)
-10 (B)
+1 (I) RNA
l Sextama Box 与 Pribnow Box 间距 17bp，有利于 RNA pol启动 间距趋近于17 bp，up mutation 间距远离于17 bp，down mutation 17bp的间距比17bp的序列对转录更为重要 l -35 Box or -10 Box mut.
原核生物顺式作用元件
原核生物顺式作用元件
原核生物顺式作用元件是指在原核生物基因表达调控中具有顺式作用特点的调控元件。
顺式作用是指调控因子结合在DNA的特定位置上，促进或抑制基因的转录。
原核生物中常见的顺式作用元件包括启动子、操作子和增强子等。
启动子是基因转录的起点，是调控元件中最常见的一种。
启动子通常位于基因的上游区域，由RNA聚合酶等转录因子的结合调控基因的转录。
操作子是一种DNA序列，在转录因子的作用下，可以诱导基因的转录抑制或激活。
操作子一般位于启动子附近，可以通过特定的转录因子结合在操作子上，调控基因的表达。
增强子是一种DNA序列，位于启动子和操作子之间，可以在很远的距离上诱导基因的转录。
增强子结合转录因子后，可以促进基因的表达，让基因在不同的条件下更高效地表达。
总之，原核生物顺式作用元件是调控基因表达的重要因素，对于维持生物正常的生理功能、适应环境变化等都具有重要作用。
- 1 -。
拟核的基本概念
拟核的基本概念
拟核（nucleoid）是原核生物细胞内的一个重要的组成部分，是细胞遗传物质的主要载体。
它没有由核膜包被，因此与真核生物的细胞核有所区别。
在形态上，拟核是一个没有明确边界的区域，通常呈现出不规则的形状。
拟核的核心成分是DNA，这种DNA分子不同于真核生物的染色体，因为它没有组蛋白的包装，也没有形成染色体的结构。
相反，拟核中的DNA是双股螺旋形式存在的环状分子，多个这样的分子拷贝会共存于一个区域内。
这种DNA分子结构使得拟核具有一定的稳定性，并保证了遗传信息的连续性。
拟核还参与了原核生物的各种生命活动，如DNA复制、转录、翻译等，从而控制着原核生物的遗传和表达。
同时，由于拟核的结构简单、功能明确，也使得原核生物的生长和繁殖变得快速和高效。
拟核除了作为遗传物质的主要载体，还具有一些其他的功能。
首先，拟核中的DNA分子可以作为基因表达的调控元件，影响基因的表达方式。
其次，拟核可以作为细胞内代谢活动的调控中心，影响细胞的代谢途径和代谢速率。
此外，拟核还可以作为细胞内信号转导的调控元件，影响细胞对外部信号的反应方式。
总之，拟核是原核生物细胞内不可或缺的重要结构，它不仅承载着遗传物质，还参与了细胞的各种生命活动，并具有多种重要的功能。
因此，了解拟核的结构和功能对于理解原核生物的生长发育和代谢机制具有重要意义。
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原核表达载体的重要调控元件
启动子
启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。
没有启动子，基因就不能转录。
由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。
原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。
在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。
来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。
在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。
转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。
-35区与RNA聚合酶s 亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。
原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。
（1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。
Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。
正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP 来激活启动子，促使转录进行。
负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。
乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。
（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。
当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。
当色氨酸较丰富时，则停止转录。
b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。
（3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。
其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac 操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。
Tac启动子受IPTG的诱导。
（4）lP L启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子。
lP L启动子受控于温度敏感的阻遏物cIts857。
在低温(30℃)时，cIts857阻遏蛋白可阻遏P L启动子转录。
在高温(45℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使P L启动子转录。
系统由于受cIts857作用，尤其适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导P L启动子，也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。
如果用l噬菌体cI+溶源菌，并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一矛盾。
（5）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。
T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。
这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。
但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶。
应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌体RNA聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体。
2．SD序列
1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。
它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。
另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质。
3．终止子
在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。
转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。
对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C 富含区域又具有回文对称结构。
这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构，并且有与A/T富含区对应的一串U。
转录终止的机制较为复杂，并且结论尚不统一。
但在构建表达载体时，为了稳定载体系统，防
止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。