未来的医学研究和应用新方向 ppt课件

• 并有可能成为药物的天然载体，应用于临 床治疗。
• Théry C是建立外泌体提取分离鉴定金标准 的泰斗(Théry et al, 2006)。
• 在Cell发表了一篇综述，文中着重讨论了EV 对癌症转移作用的最新发现，下面就是她 的综述内容
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Exosomes还是EV?
• Théry C提出应该是 "exosomes“而不是 ”exosome”(Théry, et al. 2014)
• 得到外泌体量多，纯度不足，电镜鉴定时 发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体 没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究 认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。
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1.2 过滤离心
• 过滤离心是利用不同截留相对分子质量 (MWCO)的超滤膜离心分离外泌体。
• 截留相对分子质量是指能自由通过某种有 孔材料的分子中最大分子的相对分子质量。
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EV帮助小RNA转运？
• miRNA分泌进小EV，运输进靶细胞并发挥功能，直 接调控miRNA靶标。Pegtel et al, 2010，发现小EV转 运EB病毒miRNA到邻近未感染的细胞，抑制靶基因。
• 除了EV包裹的miRNA，miRNA起的作用也有可能是 其他EV组分在靶细胞表达内源miRNA引起的。
• 外泌体是一个囊状小体，相对分子质量大 于一般蛋白质，因此选择不同大小的MWCO 膜可使外泌体与其他大分子物质分离。
• 这种操作简单、省时，不影响外泌体的生 物活性，但同样存在纯度不足的问题。
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1.3 密度梯度离心法
• 分为连续和不连续梯度离心法。
• 用于密度梯度离心法的介质要求对细胞无毒， 在高浓度时粘度不高且易将pH调至中性。实验 中常用蔗糖密度梯度离心法，在离心法的基础 上，预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5 M 和 0.25 M)配成连续梯度体系置于超速离心管中， 样本铺在蔗糖溶液上，100 000 g离心16 h，外 泌体会沉降到等密度区(1.10~1.18 g/ml)。
• 1. 肿瘤来源的EV对受体细胞有不同的作用。在 原发性肿瘤位点，EV能稳定细胞突起，增强癌 细胞运动能力。EV通过细胞外基质 (ECM) 局部 沉积，促进定向的持续迁移，例如含有纤连蛋 白(Fibronectin)的小EV。
• 2. 包含金属蛋白酶(Metalloproteinases)的EV也 可以直接参与ECM重构(Remodeling)，使特化 的细胞突起具有降解能力，也就是侵入性伪足 (Invadopodia)。ECM重构帮助肿瘤细胞在组织 之间迁移。
Exosomes：Our future target！
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简介
• 外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞 上清液中
• 细胞主动分泌的囊泡样小体 • 大小较为均一，直径为40~100纳米 • 密度1.10~1.18 g/ml
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• 细胞外泌体携带多种蛋白质、mRNA、 miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新 生和肿瘤细胞生长等过程
• 如何明确上述两种情况？转运的miRNA是外源基因 组编码的，如病毒的 (Pegtel et al, 2010) 或寄生虫的 (Buck et al, 2014)，又或者受体细胞是小鼠的，并没 有所研究的miRNA (Alexander et al, 2015)。
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EV与免疫
• 最 近报道发现肿瘤微环境中EV的RNA有着 一段特殊的序列(Boelenset al, 2014)：它带 有5'-triphosphate末端，通过RIG-I感应器被 受体细胞基质识别，诱导干扰素应答，跟 病毒感染类似。这种应答也参与癌症 细胞 对放疗或化疗的应答。
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• 3. EV可促进肿瘤基质细胞的分化或募集， 如纤维母细胞(Fibroblasts)和骨髓来源细胞 (Bonemarrow-derived cells,BMDC)。反过来， 周围纤维母细胞分泌的EV可以增强肿瘤细 胞迁移能力及耐药性。
• 4. 小EV还能进入循环，从原发肿瘤到达远 端位点。小EV的堆积可能增加血管通透性， EV可以进入远端组织，诱导ECM重构、募集 BMDC以及后来的肿瘤细胞，制造转移前微 环境(Pre-metastatic niche)。
• 因此，这些exosomes的功能可能是广义EV的，也可能 是真正的exosomes。
• 下面Théry C的综述中使用广义的EV指没有专门鉴定过大 小的囊泡，使用小EV指小于200nm的小囊泡。
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VE
exosomes
胞外其他囊泡 （来自于其他个
体或生物）
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EV帮助癌细胞长出“腿”？
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体内分析EV转移的方法
• 将标签添加到分泌的EV里 • I. 将荧光蛋白基因融合到棕榈酰化
(Palmitoylation)序列，标记全细胞膜，通过 mRNA的新荧光我们可以跟踪结合或内化了 EV的细胞 • II. 膜结合荧光素酶蛋白可以分析体内发光 细胞，这样就能捕获结合EV的荧光素酶蛋 白或荧光素酶mRNA • III.用CRE重组酶，检测EV内的mRNA
• 小EV与包膜病毒有相似作用？何种表面分 子协助受体细胞膜融合RNA或小分子内含物 到细胞 质呢？这个问题有待探索。
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外泌体分离和检测
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1. 分离
• 到目前为止，仍没有一种提取方法能同时 保证外泌体的含量、纯度以及生物活性。
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1Байду номын сангаас1 离心法
• 最常用的方法。收集细胞培养液以后依次 在300 g、2 000 g、10 000 g离心去除细胞碎 片和大分子蛋白质，最后100 000 g离心得 到外泌体。
• 因为Exosome还含有另一个含义：外切酶体复合物，具 有RNase活性。
• 分离的产物若没有进一步证明它的细胞内来源， 应定义 为混合的小EV——Extracellular Vesicles，即胞外囊泡。
• 来自多泡内体或MVB的才是exosomes，可检测囊泡是否 含内体标志蛋白证明，如CD63。 Multivesicular bodies， MVB=MVE Multivesicular endosomes