Creloxp系统工作流程
cre_loxp基因敲除系统解读ppt课件
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
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基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
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二、基因敲除的基本流程
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（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
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（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设 计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源 的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
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一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶（37℃）
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (201061).
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理Cre-loxp系统是一种常用的基因敲除技术，用于特定区域的基因敲除。
该系统是通过两种转基因技术相互配合实现的，即Cre重组酶和loxp位点。
Cre重组酶是一种由细菌噬菌体产生的酶，能够识别和剪切含有loxp位点的DNA序列，从而实现特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统的原理如下：1. Cre重组酶的表达：首先，使用基因工程技术将Cre酶的编码基因嵌入到转基因小鼠的基因组中，使其能够在特定的组织或细胞类型中产生。
通过引入特定的启动子或组织特异性表达的促进子，可以实现Cre重组酶在目标组织或细胞中的表达。
2. 基因敲除载体：在目标基因的启动子或内含子区域，插入一对loxp位点。
loxp位点是一种特殊的DNA序列，约有34个碱基对，呈倒向重复，用于诱导Cre重组酶的作用。
3. Cre重组酶的介导：一旦Cre重组酶在目标组织或细胞中表达，它能够识别和结合含有loxp位点的DNA序列，并结合在loxp位点上。
Cre重组酶在loxp位点间发生酶活性，通过识别和切割这两个loxp位点间的DNA链，将目标基因位点裂解。
4. 基因敲除效应：一旦目标基因位点被裂解，无法继续正常转录和翻译，从而导致目标基因的敲除。
这样，就实现了在特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统具有以下特点和优点：1. 灵活性：Cre-loxp系统可以在不同的组织或细胞类型中实现基因敲除，由于Cre重组酶的表达是由特定启动子或组织特异性表达的促进子控制的，因此可以实现组织或细胞特定的基因敲除。
2. 高效性：Cre重组酶的催化作用很高效，能够在较短的时间内进行特定区域的基因敲除。
3. 精确性：Cre重组酶只能识别和剪切含有完整loxp位点序列的DNA链，因此能够实现精确的目标基因敲除，而不会对其他基因产生影响。
4. 可逆性：如果需要在特定的时期或特定的组织中恢复目标基因的表达，只需停止Cre重组酶的表达即可。
flox cre小鼠基因型鉴定流程
floxed cre 鼠标代表一种基因工程的菌株，其特征是有loxP站点侧绕特定基因或基因。
将这种肌肉模型基因化的目的是明确确认软体基因
和cre rbinase基因的存在。
这种验证是研究人员不可或缺的先决条件，因为它直接影响到鼠标的phenotypic和行为特征。
基因分解程
序要求从老鼠身上提取DNA，然后扩大特定的DNA区域，然后对肽
进行分析，以确定浮离基因和cre基因是否存在。
在格诺泰平的微妙舞蹈中，第一个崇敬的步子始于从高尚的老鼠中温
柔地提取DNA。
一种小的供奉组织，无论是从耳朵还是从尾部，在经过温柔的处理以释放体内生命的精髓之前，都要以庄严的敬意来收集。
为此使用了一系列神秘的脱氧核糖核酸提取包和神圣协议，每项选择
都以虔诚的考虑为目的，考虑加固基因组仪式的具体需要。
珍贵的DNA被解放后，它被测量和稀释到一个统一的标准，确保每个片段携带相同的乙醚浓度，与宇宙的和谐共振。
基因分解程序的随后阶段，需要扩大含有loxP和cre序列的特定
DNA区域。
这一关键过程通常通过聚合酶链式反应（PCR）加以执行，这种反应使用精细设计的基本素，有选择地与上述区域结合。
随后，PCR产品通过agarose凝胶电泳检查，目的是可视化放大DNA碎片
的存在。
正乌将表现为与PCR产品预期大小相匹配的波段，表示浮离基因和cre基因的存在。
反之，负值将显示无带，表明目标基因的缺乏。
通过应用测序法或替代分子方法，可能有必要对基因组结果进行
后续核查。
基因打靶 cre-loxp重组酶系统
基因打靶基因打靶包括：胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。
基本概念：1.基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。
2.基因敲除：是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内。
3.丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。
基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。
4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。
自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。
一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源于129小鼠品系和其杂交品系（因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物）。
ES 623和B6-IIIES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。
BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系。
常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞。
PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞）。
建立ES细胞的过程中，最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，所取得的ICM（内细胞团）只有10％-30％的几率建立ES细胞系。
一旦ES 克隆被确定，接下来应该考虑检查ES细胞的核型。
creloxp基因敲除系统
Loxp site
34bp反向重复序列
Flp/Frt重组系统
P1噬菌体
（1）重组方式
（2）基因敲除机理
Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation
基因敲除机理 （续）
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (2001).
（3）阳性克隆筛选
随机整合 定点整合 没有整合
DTA(白喉毒素A亚基）
（4）囊胚注射
小鼠的遗传背 景取决于ES和 囊胚细胞
（5）嵌合体小鼠
（6）品系纯化
纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种 Loxp2小鼠品系建立完成
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。
MerCreMer融合蛋白
Cre-loxp系统
Cre-loxp系统Cre-lox系统介绍及使⽤汇总由于Cre-lox系统具有操作简单、重组率⾼的优点，如今已经成为体内外遗传操作的强有⼒⼯具。
利⽤Cre-lox系统，可以在特定细胞、组织或整个⽣物体，甚⾄在特定时间点敲除或表达某个基因，实现对特定基因的时空特异性操作，这对基因功能的研究和⼈类疾病动物模型的建⽴都具有深刻影响。
1.什么是Cre-lox系统？从名字就能知道这套系统的两个主要组成部分：(1)Cre重组酶环化重组酶（Cre,cyclizationrecombinase），是酪氨酸位点特异性重组酶之⼀，能催化两个DNA 识别位点之间的位点特异性重组。
Cre重组酶来源于P1噬菌体，由343个氨基酸组成，能特异性地识别Lox位点。
除Cre以外，此类重组酶还有Flp（flipase）和Dre（D6特异性重组酶）。
(2)Lox位点Cre重组酶识别的回⽂DNA位点，也叫loxP(locusofX-overP1)位点，长34bp，其特征结构为ATAACTTCGTATA?-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。
两边反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列，中间的8个碱基为重组发⽣位置，这也决定了loxP的⽅向。
N表⽰可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的Lox位点，除了野⽣型loxP，常见的还有Lox2272，Lox511，Lox5171等等，这些突变Lox位点也能被Cre重组酶识别，但是只有两个序列相同的Lox位点之间才能发⽣重组。
在同⼀个DNA分⼦上，根据Lox位点的位置与⽅向，可能会发⽣3种不同的重组事件：（1）切除：当两个Lox位点在同⼀染⾊体上且⽅向相同时，将切除同向Lox位点之间的DNA序列（也叫Lox侧翼序列，Flox序列）。
（2）反转：当两个Lox位点位于同⼀染⾊体上且⽅向相反时，两个Lox位点之间的序列发⽣序列反转，即颠倒。
（3）易位：如果两个Lox位点位于不同的染⾊体上且⽅向相同，则易位事件将导致DNA ⽚段的交换。
creloxp重组酶系统原理
Cre-loxp重组酶系统是一种常用的基因编辑技术，它可以在特定的DNA序列上实现特异性的编辑和改变。
本文将从原理、应用和发展趋势等方面对Cre-loxp重组酶系统进行介绍。
一、Cre-loxp重组酶系统的原理1. Cre重组酶Cre重组酶是一种来源于大肠杆菌的酶，它能够识别和结合特定的DNA序列loxp，并在该序列上引发DNA的重组事件。
Cre酶最初是在嗜盐古细菌（Archaeoglobus fulgidus）中发现的，后来被用于基因编辑和遗传工程领域。
2. loxp序列loxp序列是Cre-loxp重组酶系统中的关键部分，它是一种DNA序列，长度为34个碱基对，其中包含了两个逆向定向重组位点。
这样的结构使得Cre酶可以选择性地将该序列分为两部分，并引发DNA片段的剪接和重组。
3. Cre-loxp重组酶系统的原理当Cre重组酶与loxp序列结合后，它将在该序列上诱导DNA的重组，使得该序列内的基因组成发生改变。
这种改变可以是插入、缺失、逆向或转向等，具体取决于Cre酶与loxp序列的相对定向。
Cre-loxp重组酶系统可以实现对特定DNA序列的编辑和改变。
二、Cre-loxp重组酶系统的应用1. 基因敲除通过Cre-loxp重组酶系统，可以实现对特定基因的敲除。
具体而言，首先需要在目标细胞中导入一个含有loxp序列的质粒，然后再导入Cre重组酶。
Cre酶与loxp序列结合后，将引发目标基因的敲除，从而实现对该基因的功能破坏或消除。
2. 基因激活除了基因敲除外，Cre-loxp重组酶系统还可以实现对特定基因的激活。
这种激活方式通常是通过插入或逆向调控目标基因的转录和翻译，从而增加目标基因产物的表达水平。
3. 细胞命运的调控在细胞生物学领域，Cre-loxp重组酶系统也被广泛应用于调控细胞的命运和功能。
通过敲除或激活特定基因，可以实现对细胞增殖、分化、凋亡等过程的调控，从而揭示细胞内部的生物学机制。
Creloxp系统工作流程
Creloxp系统工作流程
利用Cre／loxP系统实现体内某特定基因在特定条件下的敲除，需要两只转基因小鼠。
第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列，之后将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。
经过这样处理的胚胎干细胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。
在这只转基因小鼠中，loxP位点被引入到相应基因的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。
第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术获得，在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达。
最后，让这两只小鼠进行交配，产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细胞中缺失某一特定的基因。
在何种组织细胞或器官中敲除某一特定的基因取决于所选择的启动子。
只要选择合适的启动子调控Cre重组酶的表达，使其在生物体特定的部位、特定的条件下产生，就可以实现相应条件下某一特定基因的敲除。
Cre—loxp系统的构建及在牙釉质发育中的应用
Cre—loxp系统的构建及在牙釉质发育中的应用Cre-loxp系统是近年来广泛应用在各领域的重组酶系统。
该系统由组织特异性重组酶cre和loxp位点组成。
可以通过对特定的DNA序列进行准确的切割及连接，达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的。
牙釉质的发育离不开各种转录因子的作用，利用该系统对各转录因子的缺失或突变的研究，探讨特定时间、特定部位目的基因的异常改变对牙釉质发育的影响。
[Abstract] Cre-loxp system is recombinant enzyme systems，widely used in various fields in recent years.The system consists of a tissue-specific recombinase cre and loxp site components.Through specific DNA sequences accurate cutting and connection，at the genetic level to achieve the purpose of orienting genetically engineered organisms.Enamel development is inseparable from the role of various transcription factors，utilization of the system for each missing or mutated transcription factors，investigate the effect of abnormal changes in a particular time parts of the gene of enamel development.[Key words] Cre-loxp system；Loxp site；Recombinase cre；Transcription factors随着国民经济的日益发展，人们对口腔保健的意识也越来越强。
cre-loxp基因敲除系统
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES，成功建 立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动 物细胞中发现并实现了同源重 组
同源重组
Homologus Recombination
同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同 一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合 。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片 段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞 后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的 配体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre 重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌 合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下 ，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶 段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥 Cre重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的 存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只 有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。
基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
cre和flox小鼠原理
cre和flox小鼠原理（1）Cre-Lox小鼠原理Cre-Lox小鼠原理是一种分子生物学技术，它可以实现快速的和有效的对特定基因进行基因操作和修饰，并具有良好的信号特异性和质量高的结果。
（2）Cre-Lox小鼠原理的工作原理Cre-Lox小鼠原理的基本原理是，基于Cre和Lox蛋白的相互作用，从而实现对基因或染色体上的特定区域的精确和有效的操作，从而实现基因调控或表达调控等功能。
在Cre-Lox小鼠原理中，Cre蛋白和Lox 蛋白作为两个蛋白，分别存储在拷贝之间的基因表达调控中，当Lox 蛋白感应到Cre蛋白的存在时，Lox蛋白的活性会受到抑制或调节，从而影响LoxP所代表的基因在基因组中的表达水平，最终影响基因的功能。
（3）Cre-Lox小鼠原理的运用Cre-Lox小鼠原理在基因表达修饰、基因组学、组织工程研究中广泛应用。
基因表达修饰：使用Cre-Lox小鼠原理，可以实现基因表达水平中调控微环境所致的基因表达修饰，从而改变蛋白质的结构和功能，以达到精准治疗的目的。
基因组学研究：Cre-Lox小鼠原理的使用可以由基因组中的每一个可突变的特定位点来实现快速和有效的重组。
从研究显示，这一技术可以有效实现基因组结构中可识别特快慢特定基因的检测和改变，从而提供更多的研究信息。
组织工程研究：结合小鼠基因改造技术，开发出来的Cre-Lox小鼠技术可以将所需的基因插入到不同的位置，实现细胞组织的分离、表达重组和重构，从而实现治疗性的细胞治疗和免疫研究。
（4）注意事项Cre-Lox小鼠原理的主要优点是：信号特异性好、操作效率高、结果可靠性高。
但由于该技术的操作规则复杂，需要对生物学及分子生物学基础掌握有一定的了解和深度，在使用Cre-Lox小鼠原理进行操作前，必须正确理解Cre和Lox之间的协同关系，并明确相应操作的具体流程。
此外，在进行Cre-Lox小鼠原理的操作时，要根据外部干预措施和基因表达特性给出明确的指令，以便实现所需的目标效果。
flox cre小鼠基因型鉴定流程
英文回答：The genetic identification of mice is an important experiment that requires rigorous operating procedures. End tissue samples from mice need to be prepared or a small number of tail tissues or blood samples collected for subsequent PCR enhancements. During the PCR build—up, suitable quotations must be designed to selectively zoom in the specific fragments of the feox and cre genes. The length and purity of DNA fragments are tested through gel electron swimming to confirm the success of the PCR build—up. Once the expansion has been successful, the next steps in genetic identification can be undertaken. This work needs to be carried out in strictpliance with the required technical standards and processes to ensure the accuracy and reliability of the results of the experiments.小鼠基因型鉴定是一项重要的实验工作，需要进行严格的操作流程。
rescue实验转染步骤
rescue实验转染步骤背景技术：在细胞中敲除靶基因并观察所得表型是生物学研究中确定一个基因功能最常用的方法。
然而，有一些基因是维持细胞存活必不可少的，称为必需基因。
直接敲除必需基因，将导致细胞死亡，无法研究敲除后对细胞功能的影响。
这类基因只能靠条件性敲除研究。
已有的几种条件性敲除方法总结如下：（1）cre/loxp重组系统是条件性敲除必需基因最常用的方法。
该技术需要在靶基因两侧插入一对34bp的loxp位点，在cre重组酶作用下，两个lox位点之间的序列会发生重组删除。
所用的cre重组酶一般为mer—cre—mer，加雌激素cre可以发挥重组功能。
cre 需要整合到基因组上表达。
（2）另一种常用的方法是利用tet—on/tet—off调控基因表达。
首先构建一个稳定表达转录激活因子tta的细胞系，然后将tre启动子插入到内源基因上游启动子序列中，这样就可以调控内源基因表达。
也可以先引入外源基因，再将内源基因敲除，外源基因启动子为tre 启动子，受dox调控表达。
然而这些方法都需要多个步骤来构建外源基因稳定整合的细胞系，耗时耗力。
研究突变对基因功能的影响时，往往需要将突变引入到内源基因上，工作量很大。
技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明目的在于提供一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法及研究必需基因突变体功能的方法。
本发明方法简单、快速、有效。
本发明通过构建同时存在条件下细胞才能存活的一个双质粒系统，把crispr/cas9基因编辑系统、tet—off诱导调控系统和外源基因克隆到这个双质粒系统中，实现必需基因条件性敲除。
本发明的技术方案具体介绍如下。
本发明提供一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法，具体步骤如下：（1）构建双质粒系统，双质粒系统包含ko质粒（敲除质粒）和rescue质粒（营救质粒），ko质粒含有用于敲除内源基因的sgrna 和cas9基因，用于调控外源基因表达的tta基因和负责质粒在真核细胞中复制的ebna1和orip元件；rescue质粒含有补偿敲除的必需基因的外源补偿基因，用于筛选转染成功细胞的抗药基因和在ebna1蛋白的作用下可以使质粒在真核细胞中复制的orip元件；将靶向目的基因的sgrna克隆到ko质粒上，将外源补偿基因cdna克隆到rescue质粒上；（2）将双质粒系统转染到细胞中，在药物筛选下培养若干天，分选单克隆，测序鉴定，即筛选出必需基因纯合敲除的细胞系。
2016-Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用
非同源末端连接（non homologous end joining, NHEJ）
第九页，共27页。
新3代基因组编辑工具
均由自然界存在的核酸酶系统改造而来
均具有识别核酸碱基特异性的结构域 作用机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从而诱
4. 可同时对多个基因进行操作而ZFNs和TALEN两项技术则难以实现这种效果。
5. 多种功能性蛋白都可以通过与Cas9蛋白融合，
然后利用gRNA的靶向作用结合到dsDNA的任意位点，
发挥人们预期的功能。
第十四页，共27页。
3. 病毒载体
第十五页，共27页。
3Байду номын сангаас1 病毒载体比较
第十六页，共27页。
Cre-dependent Cas9 mice
第二十五页，共27页。
思考题
阐述Cre-LoxP技术的基本原理和程序。 CRISPR-Cas9技术与ZFN、TALEN相比均有哪 些优势？ 举例说明CRISPR-Cas9技术与病毒工具的组合
应用。
第二十六页，共27页。
Thanks for your attention
第二十七页，共27页。
Content
第一节、Cre-loxP技术 第二节、 CRISPR-Cas9技术
第三节、病毒工具简介 第四节、组合应用示例
第一页，共27页。
基因操作技术一览
第二页，共27页。
1. Cre-loxP技术简介
Cyclization recombinase
Cre蛋白于1981年从P1噬菌体中被发现，属于λInt酶超基因家族。 Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp, 编码343个氨基酸, 38kDa, 单体蛋白。 Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能特异地在两个loxP位点间发生基因重组。 Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。
条件性基因敲除的“时空开关”——Cre-loxP系统介绍
条件性基因敲除的“时空开关”——Cre-loxP系统介绍基因敲除小鼠是我们研究基因功能必不可少的利器，主要分为全身性基因敲除和条件性基因敲除。
然而，全身性基因敲除的小鼠存在着无法忽视的缺陷，例如：不能特异性地研究特定基因在特定组织内（及特定的时间）的功能；全身性基因敲除小鼠有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩；或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡；或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。
因此，条件性基因敲除小鼠虽然有周期长、费用高、需要配合特定工具鼠使用等劣势，但仍获得了越来越多的选择与喜爱。
今天，就和大家一起来了解下条件性基因敲除方法必用的Cre-loxP重组系统以及应用Cre-loxP进行条件性基因敲除的原则。
概述Cre-loxP重组系统，即对一段特定的DNA序列进行定位并用Cre 重组酶对其进行剪接，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。
其中Cre蛋白，最初由“导致重组（Cause recombination）”命名，也有文献命名为“环化重组酶（Cyclizationrecombinase）”。
Cre重组酶（CyclizationRecombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。
它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点, 从而重组或删除loxP片段间的基因。
loxP（Locus Of X-over P1）是P1噬菌体基因组中34bp的特殊位点序列，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。
其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向，间隔区中的“N”代表这个碱基是可变的：发展历史1985年，R H Hoess, K AbremskiCre-Lox首次发表了大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统的断裂和交换机制文章。
1987年，Brian Sauer博士把大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统在酿酒酵母中即真核系统中进行了功能表达，提出了Cre介导的位点特异性重组可能是调节真核生物基因组重排的有用工具的预想。
一分钟看懂基因编辑神器「Cre-LoxP」
一分钟看懂基因编辑神器「Cre-LoxP」Q师弟小花师姐，我最近看到什么DO、DIO、FLEX系统的，据说都是Cre-LoxP系统，那么他们之间有什么差异啊？小花师姐师弟，要了解这三种系统的差异，我们首先必须先了解什么是Cre-LoxP系统。
Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，能够控制基因组DNA中位点特异性重组的发生，被广泛应用于特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位，可达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的，其主要由Cre与LoxP两部分组成。
Cre是一种重组酶，于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。
Cre重组酶，能够特异性识别LoxP位点，使2个LoxP 位点之间的DNA进行精确的位点特异性重组。
LoxP则是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定了LoxP的方向。
LoxP位点的序列如下所示：其中，“N”表示可能变化的碱基。
通过高通量筛选，我们获得了不同的LoxP序列，如下表所示：不同LoxP位点序列表那么当Cre与LoxP相遇时，他们之间又将发生怎样的故事，使得Cre-LoxP系统名气大振呢？主要有以下三种情景哦~✫情景一当两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反时，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转（图1A）；✫情景二当两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效地敲除两个LoxP位点间的序列（图1B）；✫情景三当两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre 重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位（图1C）。
图1 Cre-LoxP系统基本工作原理示意图However，从以上情景我们也可以看到在Cre酶存在时，A、B、C三种场景的变化其实是可逆的，那么该如何使这种动态变化达到一种稳定状态呢？如下图所示，通过引入两对不同的LoxP位点，经过两组LoxP点的两轮重组我们即可达到一种稳定状态。
条件性基因敲除与敲入
迄今为止，研究者们已经成功地利用多个不同 的启动子实现了在不同条件下的基因敲除，这 些启动子可以是细胞类型特异的，如lck启动子 (胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(眼晶 状体)、钙调素依赖性激酶Ⅱ启动子(海马和大 脑新皮质)、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、aP2 启动子(脂肪组织)、AQP2启动子(肾脏集合管) 和肌浆蛋白启动子(骨骼肌)等。启动子也可以 受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的 基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功 能的异常所产生的副作用，如干扰素反应Mxl 启动子、他莫西酚依赖的雌激素突变体启动子 和四环素调节系统等。
受精卵雄性原核显微注射法构建Cre 转基因动物
Cre转基因动物即时空特异性表达重组酶Cre的转基 因动物。构建此动物的目的在于为loxP转基因动物 提供重组酶Cre。由于在该转基因动物中Cre的表达 被臵于特异性启动子的调控之下，因此它会以组织 细胞特异性和发育阶段特异性的方式向loxP转基因 动物提供Cre重组酶，以便在特定的发育阶段、特定 的组织细胞中使两个loxP之间的区域缺失。当然， 实现此目标的最后方法就是让这两种转基因动物进 行杂交。 构建Cre转基因动物与构建普通转基因动物的方法相 似，最为常用的基因转移方法仍为受精卵雄性原核 显微注射法和胚胎干细胞的囊胚注射法。
loxP转基因动物的构建一般采用胚胎干细胞基因转 移法。在这个过程中，首先要构建具有3个loxP位点 的打靶载体。该载体中loxP位点的分布情况如下： 选择标志基因(如neo—tk)的两侧各一个，从而能够 使选择标志基因在Cre的介导下消失，以避免它们在 基因组中的存在可能给转基因动物造成危害；预期 要进行敲除的基因两侧各一个，在Cre的作用下可以 介导目标基因的敲除。在载体构建成功后，用电穿 孔等方法将其导入到胚胎干细胞中，使其以同源重 组的方式整合进干细胞的基因组，之后经G418筛选， 用PCR和DNA印迹(Southern blotting)等方法来确定 靶基因是否发生了同源重组。最后，为了去除筛选 标志基因，要向上述的胚胎干细胞中导人Cre的瞬时 表达质粒。这时，在Cre的作用下，具有3个loxP位 点的靶基因区域会产生3种后果：
Cre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记
Cre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记背景Cre/LoxP系统来源于F1噬菌体，是非常经典有效的基因编辑技术。
1. 什么是CreCre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA 重组。
Cre就是一个重组酶，可以识别LoxP位点。
/cre-lox/ addgene上的介绍（1）如果loxP位点位于相同的DNA链上，并且方向相反，那么重组就会导致反转，并且loxP位点之间的DNA区域是反向的。
（2）如果这些位点面向同一方向，则loxP位点之间的序列作为一段环状DNA被切除(并且不被保留)。
（3）如果这些位点位于不同的DNA链上，loxP位点就会产生一个易位事件。
image.png首先我们需要将Cre载入到细胞中，此时已经有成熟的试剂盒可以做到。
通过CRISPR-Cas9系统，可以将CreER插入到AAVS1（腺样病毒相关位点1），藉由AAVS1安全港的作用，稳定表达CreER。
可是CreER可能会泄露，既在没有他莫昔芬的情况下，也可能会敲LoxP（简称犯浑），这时候应该加入双重保障。
Cre调控方式Inducible Cre: These constructs require the addition of an exogenous ligand (e.g. tamoxifen) to activate Cre. One advantage of this system is tight temporal regulation.（1）诱导Cre：这些结构需要添加外源性配体(如他莫昔芬)来激活Cre。
这个系统的一个优点是严格的时间管理--这一个是我们最常用到的！Promoter-regulated Cre: The promoter region defines the areas in which Cre will be expressed. Cre may be expressed globally under a broadly active promoter like CAG, or expressed only in a subset of cells under a more specific promoter (e.g. Rho-Cre is expressed in the retina).（2）启动子调控的Cre：启动子区域定义了Cre表达的区域。
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Creloxp系统工作流程
利用Cre／loxP系统实现体内某特定基因在特定条件下的敲除，需要两只转基因小鼠。
第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列，之后将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。
经过这样处理的胚胎干细胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。
在这只转基因小鼠中，loxP位点被引入到相应基因的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。
第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术获得，在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达。
最后，让这两只小鼠进行交配，产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细胞中缺失某一特定的基因。
在何种组织细胞或器官中敲除某一特定的基因取决于所选择的启动子。
只要选择合适的启动子调控Cre重组酶的表达，使其在生物体特定的部位、特定的条件下产生，就可以实现相应条件下某一特定基因的敲除。