烟草染色体倍性快速鉴定方法

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2006,14(2):255~258*基金项目：国家自然科学基金(No.39870421),国家烟草专卖局项目(No.G1*******)和浙江省重点科研项目(No.2003C22007)资助。

作者简介:朱惠琴女，1969年生，硕士。

**通讯作者。

Author for correspondence.E-mail ：<qzhxue@>.收稿日期：2004-05-08接受日期：2004-07-19·研究论文·烟草染色体倍性快速鉴定方法*朱惠琴1，2,张宪银1,薛庆中1**(1.浙江大学农业与生物技术学院，杭州310029;2.青海大学农牧学院，西宁810003)摘要:对两个杂交组合(G28×NC2326和K326×Coker176)F 1烟草()花药培养诱导出763个不同倍性植株。

基于植株的花和种子结实率常规鉴定倍性水平比较，用气孔保卫细胞叶绿体数目预测植株倍性准确率达93.52%。

表明采用气孔保卫细胞叶绿体计数法可以在苗期快速、准确地确定植株染色体倍性。

同时,在移栽前间接地鉴定、筛选出叶绿体数<14的单倍体苗，作进一步秋水仙碱加倍处理，以减少对单倍体材料的浪费，加快DH 群体构建速度。

关键词:烟草；倍性；叶绿体；DH 群体中图分类号:S184文献标识码:A文章编号:1006-1304(2006)02-0255-04Rapid Determination of Ploidy Level of Chromosome in Tobacco()ZHU Hui-qin 1，2,ZHANG Xian-yin 1,XUE Qing-zhong 1**()The ploidy level of 763anthers deirived from both crosses (G28×NC2326and K326×Coker176)of tobbaco ()were determined.The result of identification by counting the number of stoma chloroplast in guard cell was consistent withthose observations of flower and seed fertillity of the plants,with the average accurate rate of 93.52%,showing that measurement of the number of stoma chloroplast in guard cell could be considered as a fast and accurate method to determine haploid,diploid or poly-ploid of tobacco in the seedling stage.In order to reduce the waste of haploid plants and speed up establishment DH population,it was feasible to select out undoubted haploid plants with <14chloroplast number in stoma treated with colchicine when young plantlets just transplanted in thefield.tobacco;ploidy level ;chloroplast;DH population.从烟草花药培养诱导的植株几乎全部是单倍体，通常需要对单倍体植株进行秋水仙碱处理，完成染色体的人工加倍。

但如果加倍频率不理想时，通过对处理植株的染色体倍性早期快速鉴定，对尚未加倍的单倍体材料，继续加倍，是构建DH 群体十分重要的技术环节。

传统的倍性鉴定是基于对根尖细胞染色体计数，但是，普通烟草染色体数多(2=48)、且小，经药物处理后中期的染色体长度也仅为2~4μm (Li,1991)，制作细胞染色体制片需要相当熟练的实践技能，并且这种方法过程烦琐、费工费时。

虽然已有其它替代鉴定方法的报道(Chandler and Lyrene,1982;Powell .,1988;Sari .,1999)，但未曾作过大规模的筛选，其实用性尚待验证。

本实验根据构建烟草DH 群体的需要，通过多种方法比较，重点探讨气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定法应用价值，成功地构建了2个DH 群体;完善了烟草染色体倍性早期快速鉴定的方法。

1材料和方法1.1供试品种在烟草()现蕾期采集G28×NC2326和K326×Coker176两组合F 1花蕾，取花药培养在H 培养基上(Bourgin and Nitisch ，1967)诱发单倍体试管苗，小植株用秋水仙碱添加二甲基亚砜(DMSO)进行加倍处理获得加倍单倍体植株，随后种植并观察加倍单倍体植株性状。

农业生物技术学报2006年图1.烟草不同倍性植株的保卫细胞及其叶绿体Fig.1.Stomata guard cells and their chloroplast at different ploidy levels in tobaccoA.单倍体;B.二倍体;C.多倍体.A.Haploid;B.Diploid;C.Polyploid.1.2倍性鉴定方法对经过加倍处理的烟草，从第4片真叶完全出现开始，撕取样叶的下表皮于载玻片上并滴加10000mg/L 的碘-碘化钾(1∶3)染色，加盖玻片后，在40×的显微镜下计数保卫细胞内的叶绿体数；每叶片随机选取5个气孔，观察叶绿体数目并计算平均数。

在开花期观察不同倍性材料的开花及其结实情况并验证叶绿体鉴定结果。

对各组合的单倍体、二倍体及多倍体材料按1、4、7、10和13叶位的完全展开叶片分别取样，制片观测气孔叶绿体保卫细胞数目。

2结果和分析2.1保卫细胞叶绿体数与染色体倍性的相关性不同组合和倍性间气孔叶绿体数目平均值及方差分析(表1)显示：气孔保卫细胞叶绿体数目随倍性增加而增加，不同倍性烟草植株气孔保卫细胞叶绿体数目的平均值差异极显著(<0.01)，而不同组合同一倍性间差异不显著(>0.05)。

因此，烟草植株气孔保卫细胞叶绿体数目平均值可以作为染色体倍性水平的鉴定依据(图1)。

烟草植株为异源四倍体，其染色体数为2n=4x=48，单倍体的染色体数n=24；烟草加倍单倍体气孔保卫细胞叶绿体数平均为21.28，单倍体为11.02，多倍体为32.25(表1)，加倍单倍体和单倍体气孔保卫细胞叶绿体平均值之比为1.9∶1，通过χ2检验，符合二倍体和单倍体2∶1比例。

2.2利用保卫细胞叶绿体计数法鉴定倍染色体性对763个花粉植株，显微镜统计第4叶气孔保卫细胞叶绿体数目，以预测染色体倍性结果(表2)。

与常规花和育性差异鉴定倍性的方法比较，用气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定植株倍性的准确率达93.52%。

G28×NC2326和K326×Coker176组合的准确率分别为95.45%和92.11%，说明该方法应用于烟草染色体鉴定非常有效。

表1烟草不同倍性植株气孔叶绿体数的比较Table 1Comparisons of stomata guard cells and their chloroplast at different ploidy levels in tobacco不同字母表示平均值在5%或1%水平差异显著。

Different letters show significant differences between mean values according to Duncan significance test at 5%or 1%level.2.3不同叶位对保卫细胞叶绿体数的影响对1、4、7、10和15叶不同叶位气孔保卫细胞叶绿体的测定结果表明，除第1叶外，第4、7、10和15叶气孔保卫细胞叶绿体数的平均数非常接近(表3)。

由此可见，取第4叶或以上叶片进行鉴定，其结果稳定可靠；以4叶以下作鉴定材料，倍性单株间差异显著，鉴定误判率达45%左右；同时，4叶以下的组织太幼嫩难于制片观察。

故本实验采用第4叶统计气孔保卫细胞叶绿体数目作鉴定，并据此构建DH 群体。

2.4不同倍性植株气孔叶绿体数的分布对单倍体，二倍体和多倍体植株气孔保卫细胞叶绿体数分布χ2检验，分别近似符合N (11.01，2.98)，N (21.28，4.74)，N (32.25，4.94)的正态分布(图2)。

其中，单倍体叶绿体数多分布在6~13，二倍体多分布在12~26，多倍体大多分布在21~38范围内。

因此，将叶绿体数12、26和32确定为区分单倍体、二倍体、多倍体的染色体倍性指标(表4)。

虽然少量植倍性水平组合Crosses平均值Ploidy levels G28×NC2326K326×Coker176Average 单倍体Haploid 12.69.4311.02aA 二倍体Diploid 20.9621.621.28bB 多倍体Polyploid32.3432.1532.25cC256第2期朱惠琴等：烟草染色体倍性快速鉴定方法组合Crosses 表2用保卫细胞叶绿体计数鉴定倍性水平的准确率Table 2Accuracy of determination ploidy levels by the count of chloroplast number of stomata guard cells in tobacco表3烟草不同倍性植株不同叶位气孔保卫细胞叶绿体数Table 3Stomata guard cell chloroplast number of leaf position at different ploidy levels in tobacco表4烟草不同倍性植株气孔叶绿体数分布频率Table 4Destribution frequencies of stomata chloroplast number at different ploidy levels in tobacco叶绿体计数鉴定花和育性鉴定By conting chloroplastBy observing flower and fertility单倍体二倍体多倍体单倍体二倍体多倍体Haploid Diploid Polyploid Haploid Diploid Polyploid G28×NC2326428206154581991475495.45K326×Coker17633524338272323512492.11Total763449192854311827893.78准确率/%Accuracy叶位保卫细胞数平均值变幅变异系数/%Leaf positions No.of guard cellsAverageRangesCV单倍体Haploid113347.894~1430.53484011.024~1617.32775011.564~1817.651073511.884~1817.321572412.016~1918.00二倍体Diploid144018.9212~2728.46470221.2814~288.09712521.9612~268.781020521.8316~268.961510022.3316~268.96多倍体Polyploid15628.3222~3626.6544532.2526~4211.5575032.7526~3811.34103233.0227~4311.96153533.9527~4611.01株各倍性间叶绿体数出现一定程度的重叠(图2)，但只要计数足够多，其准确率相当高。