Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤转染是指将外源DNA或RNA导入到目标细胞中的过程，LIPOFECTAMINE2000是一种常用的转染试剂。
下面是使用LIPOFECTAMINE2000进行转染的详细步骤：步骤一：细胞处理1.1培养要转染的细胞株，并确保细胞达到70%-80%的密度。
1.2使用无菌PBS洗涤细胞，将细胞悬浮于含有10%FBS的完全培养基中。
1.3通过计数细胞数来得到适当的细胞密度，以确保每个孔或皿中有足够的细胞进行转染。
步骤二：DNA/RNA和转染试剂的配制2.1在无菌离心管中配制DNA/RNA和转染试剂的混合液。
按照试剂的说明书中的推荐比例将DNA/RNA和转染试剂混合在一起，并使用无菌PBS 或者培养基和其它试剂进行稀释。
2.2轻轻摇晃混合液，避免产生气泡。
步骤三：转染3.1将配制好的转染混合液加入到每个孔或皿中，并轻轻摇晃培养皿/板使其均匀分布。
3.2将细胞和转染试剂混合液共孵育4-6小时，在37℃的CO2培养箱中进行转染反应。
转染时间可以根据目标细胞的特性进行调整。
步骤四：更换培养基4.14-6小时后，将转染混合液完全去除，并用预温热的完全培养基洗涤细胞，以去除未吸附的DNA/RNA和转染试剂。
4.2加入足够的完全培养基来覆盖细胞，尽量减少液体涡流，以避免对转染效率的不良影响。
步骤五：细胞培养和分析5.1将培养皿/板放回37℃的CO2培养箱中，并进行适当的培养条件。
5.2根据实验需要的时间点收集转染后的细胞进行后续的实验和分析。
需要注意的是，转染步骤中的各种参数（例如细胞密度、转染试剂的浓度和比例等）可能因不同的实验目的和目标细胞而有所不同。
因此，在具体操作中请参考所使用转染试剂和目标细胞的说明书，并根据实验需要进行相应的优化。
转染试剂转染步骤
Lipofectamine 2000 转染试剂转染步骤（24孔板/6孔板）：一:瞬时转染(贴壁细胞)1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板在500 μl/2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中(每孔0.5-2×105 /3×105 胞)。
使其在转染日能达到90-95％的融合。
2.对于每孔细胞，使用50ul/250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释0.8ugDNA/ 4.0ugDNA，轻轻混匀。
3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，每孔细胞用50ul/250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基)稀释2ul/10ul Lipofectamine 2000转染试剂.轻轻混匀,室温孵育5分钟。
NOTE：Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟后同稀释的DNA混合（<30分钟）。
长时间孵育会降低活性.若使用DMEM培养基稀释，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。
4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）, 此时总体积是100 ul/ 500ul。
轻轻混匀,室温放置20分钟以使DNA- Lipofectamine 2000复合物形成。
溶液可能会比较浑浊,但这不影响转染效率. DNA- Lipofectamine 2000复合物室温放置6小时都比较稳定.5.（optional）将24孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。
加入0.5ml/2ml 无血清配养基。
6.逐滴加入100 ul/500ul 脂质体/DNA混合物到每孔中（从培养孔一边到另一边），边加边前后来回摇动培养板，轻轻混匀。
7.在37℃，5％CO2中孵育24-48小时。
无需去掉复合物或更换培养基。
或者在4-5小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。
8.在细胞中加入复合物24-72小时后，荧光镜下观察转染效率, 分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测各项指标。
lipofectamine 2000
细胞转染
(1) 转染前一天，用胰酶消化对数生长期的BGC细胞并计数，以3.5×105/孔，将细胞接种于2mL 含10%胎牛血清的无抗生素培养基的6孔培养板中。
(2) 铺板次日，待细胞贴壁生长汇合度约80%，将6 孔板中每个孔的旧培养基吸尽，用不含血清的OPTI-MEM 培养基洗涤细胞2 次，然后 6 孔板每个孔中加入1.5mL 的无血清的OPTI-MEM 培养基。
(3) 取出Trop-2载体，空载体和脂质体Lipofectamine 2000 放置室温中，使其融化。
(4) 对于每孔细胞，用200ul OPTI-MEM 培养基分别稀释Trop-2载体2微克，空载体1微克，轻轻混合。
(5)取5u1 Lipofectamine 2000 缓慢加入至200ul OPTI-MEM 培养基中，并将两者轻轻混均，室温孵育5 分钟。
(25min内进行下一步操作)
(6) 将稀释后的Lipofectamine 2000 分别与Trop-2载体，空载体混合，轻柔操作，以防破坏Lipofectamine 2000 和RNA 链断裂，室温孵育20 分钟。
(7) 缓慢均匀的将上述复合物加入到相应孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
(8) 将培养板放入37℃，5%的CO2 培养箱中孵育6 小时后，换含10%胎牛血清的无抗生素1640 培养液继续。
Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项
Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项发布日期：2010-11-13 21:29:08 浏览次数：338Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项众所周知，Invitrogen脂质体2000是广大老师所熟知的转染试剂，其特点：转染步骤快速简便（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕。
（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基。
我们介绍一下 Invitrogen脂质体2000的操作流程、注意事项等。
一、操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
1、转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2、对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
3、对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
4、混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。
复合物可以在室温保持6小时稳定。
5、直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
lipo2000转染操作步骤
Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤1.准备转染试剂：取出存储在-20℃的LIPOFECTAMINE2000试剂，并将其溶解在适量的去离子水或者PBS缓冲液中，制备转染试剂。
2. 根据实验需要确定转染的质粒DNA量和细胞数量。
一般来说，每个转染需要1-2ug的质粒DNA，细胞密度则根据细胞类型的不同而有所变化。
3.将准备好的转染试剂和质粒DNA混合在一起。
首先将质粒DNA加入到含有LIPOFECTAMINE2000的管中，并轻轻混合均匀，然后将混合物静置15-30分钟，使其形成脂质-DNA复合物。
4.在脂质-DNA复合物静置的同时，准备待转染的细胞。
将细胞用无血清培养基洗涤一次，并将其悬浮在新的无血清培养基中。
5.将静置好的脂质-DNA复合物滴加到细胞中。
将脂质-DNA复合物滴加到含有细胞的培养皿中，并轻轻摇晃培养皿，使复合物均匀分布在细胞表面。
6.将转染后的细胞培养在37℃的CO2培养箱中孵育。
具体培养时间视实验需求而定，一般来说，24-48小时后可以进行下一步实验。
7. 检测转染效率。
可以通过荧光显微镜观察细胞内是否表达了目的基因或荧光标记，也可以采用Western blotting或者RT-PCR等方法进行进一步的检测。
总的来说，LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤相对简单，但需要注意的是在每一步操作中都要轻柔并避免产生气泡，以确保脂质-DNA复合物可以均匀地与细胞相结合，从而提高转染效率。
同时，在实验过程中需要注意质粒DNA的质量和浓度，以及细胞的健康状态，这些因素都会对转染效果产生影响。
希望以上介绍对您有所帮助，祝您实验顺利。
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤转染是一种将外源DNA或RNA导入到细胞内的技术，以研究基因功能、蛋白质表达、细胞信号转导等方面的问题。
LIPOFECTAMINE2000是一种常用的转染试剂，广泛应用于多种细胞系中。
以下是LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤的详细介绍。
一、细胞种植与处理准备1.1细胞传代：将细胞进行传代，以保证其在良好的状态下进行实验。
1.2细胞密度调整：将细胞于适宜培养皿中培养至60-80%的密度，以保证细胞的适宜转染。
1.3细胞处理准备：在转染前，将细胞用无酶EDTA或胰酶剥离并重新悬浮在适宜的培养基中，以保持细胞的完整性和适宜的状态。
二、试剂配制2.1DNA或RNA的制备：将外源DNA或RNA在无菌条件下制备，并使用纯化试剂进行纯化和浓缩。
2.2转染试剂配制：将冻干的LIPOFECTAMINE2000转染试剂通过加入合适的无菌水，稀释成适宜浓度的转染试剂。
三、转染操作3.1转染试剂与DNA/RNA的混合：将适量的LIPOFECTAMINE2000转染试剂与DNA或RNA混合在无菌的管中，轻轻混合均匀。
注意，避免过量试剂和核酸的使用，以减少细胞的毒性和副作用。
3.2孵育混合物：将混合物在常温条件下孵育15-30分钟，以促使脂质体与核酸形成稳定的复合体。
四、转染过程4.1转染试剂与细胞的混合：将混合物缓慢滴加到处理好的细胞培养基上，缓慢摇晃培养皿以使混合物均匀分布。
4.2转染时间及培养条件：将细胞放置在转染液中，保持静止状态，同时将培养皿放回培养箱中，在37℃、5%CO2的恒温恒湿条件下进行转染。
转染时间需要根据细胞系和转染试剂的要求进行优化，一般为4-6小时。
4.3转染液的去除：将转染液小心去除，并将细胞用含有适宜抗生素或筛选剂的培养基洗涤一次，以去除残留的转染试剂。
五、细胞处理及分析5.1细胞培养：将细胞放回恒温恒湿培养箱中，用适宜培养基进行细胞的培养。
lipo2000转染操作步骤
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例,其余规格得转染见表11 中板,细胞密度为30-50%适宜。
注意:根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度,如果转染后需要长时间后检测,则细胞中板密度适当降低,已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天(24-36小时后)每个孔转染方式如下:A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中,混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合,放置20min。
3 转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中,4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高,转染效率,表达效率也越高,并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞:0、5-2X105 cells/well,第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞:4-8X105 cells/well,中板后随即转染。
2 转染。
A 将0、8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中,混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合,放置20min。
转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中,4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1、 Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*:中板密度根据不同细胞不同实验有所不同,这里仅提得数据仅供参考**:6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***:6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
Lipofectamine2000细胞转染protocol
Lipofectamine2000细胞转染protocol1、预处理：转染前一天，换液，胰酶消化细胞并计数，25c㎡的培养瓶中长满细胞可达5×10^6/mL，取3-4×10^5细胞铺在2mL的培养基中（不含双抗含血清），使其在转染时密度为90-95%（张老师做法：在细胞传代时用1mL胰酶消化，再加入4mL培养基（不含双抗含血清）中和。
800rpm，离心5min，5Ml培养基（不含双抗含血清）吹散后计数，留取1mL继续培养，其余按所需分装到4个6孔板，没孔加培养基至2mL）。
2、质粒DNA配制：每孔2ug质粒DNA，用无血清双抗OPTI-MEN培养基稀释至250ul；多孔可批量配制。
质粒DNA配好后，涡旋，瞬离。
3、Lipofect配制：每孔5ul lipofect试剂，用OPTI-MEN培养基稀释至250ul温和混匀，温室放置5min；多孔可批量配制。
4、将稀释的质粒DNA和Lipofect，混合在一起（配制后30min内混合），室温保温20min，保证每孔总体积500ul。
溶液可能变浑浊，但不影响转染。
（DNA-Lipofect复合物室温下6小时内保持稳定）。
5、将前天孵育的6孔板取出，处理细胞。
用移液管吸去上清（注意从边缘吸取，尽可能不要吸去贴附细胞）。
6、每孔2mLPBS清洗1遍，注意移液管要对着边缘加液，不可吹起细胞。
7、每孔用1mLDMEM清洗2遍。
8、每孔先加入OPTI-MEN0.9mL，再加500ulDNA-Lipofect复合物，摇动培养版，轻轻混匀（加质粒DNA时注意不要碰管壁）。
9、置入CO2培养箱，在6h后更换培养液，弃去上清，加入2mL不含双抗的DMEM。
10、再次置入CO2培养箱，72小时后，吸收上清至50mL离心管。
500转，10min 离心，取上清1mL/管（1.5mL进口EP管）分装标注，冻存-80°。
另取200ul 至2mLEP管检测HBsAg定量。
Lipofectamine 2000转染说明
CAT. NO. 11668-027 Size:CAT. NO. 11668-019 Size: ml4℃储存（不要冻存）说明：Lipofectamin TM2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点：对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在的细胞系数据库中有各种细胞转染成功的实例。
在含有或是不含有血清的培养基中，DNA- Lipofectamin TM 2000复合物能够直接加给细胞。
在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养4-6小时后需要除去复合物。
关于转染的一些重要建议：1.不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。
在上有转染步骤，登陆后点击说明。
2.对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(μg)与Lipofectamine TM 2000(μl)的比例在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。
注意：在混合之前，我们建议用Opti-MEM I 低血清培养基（Cat: ）（reduced serum medium）稀释Lipofectamine TM2000和DNA.3.为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化混浊度。
此外，在实验过程中保证相同的接种条件。
4.为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。
5.由于一些无血清复合物（如CD239、SFM II、VP-SFM）会抑制阳离子脂质体介导的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和Lipofectamine TM 2000的相容性。
转染步骤（用于DNA）：按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。
对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。
步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。
1.贴壁细胞：转染的前一天，在500μl无抗生素培养基中接种×105个细胞，以保证在转染时候细胞的混浊度达到90%-95%。
贴壁细胞的脂质体转染(转)
一、实验材料1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基+ 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）3、溶液2：X ul 无血清培养基+ 4 ug 质粒per well（总体积250 ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。
三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
转染率很高。
以下是个人经验，与大家分享。
1.细胞的状态。
这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。
有文献说传代不要超过17代。
我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。
2.细胞的融合度。
lipo2000转染操作步骤
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
lipo2000转染操作步骤
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
lipo2000转染操作步骤
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
转染技巧资源
以Invitrogen的Lipofectamine 2000为例，需要注意以下几点：
1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~3
2、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。
3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。
步骤如下：以24孔培养板为例
1、转染前一天细胞换新的培养基
2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:
a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；
b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；
c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；
3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；
4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。
加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度。
5、等细胞在G418作用下，长满后冻存几支（保种）。
再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔）。
第二天在显微镜下，寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中，最后转移到培养瓶中培养，冻存，鉴定。
6、鉴定成功后，建议马上做后续实验，因为在培养过程或冻存中，转进去的基因容易从细胞中掉下来。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。
复合物可以在室温保持6小时稳定。
直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。
在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。
在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。
这依赖于细胞类型和启动子活性。
对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。
进行稳定表达需要数天或数周。
对于96孔板培养，不再需要提前一天进行细胞铺板，而可以直接在平板中制备复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了，这样进一步减少了转染时间。
这种改进步骤已经过293-H，293-F，COS-7L和CHO细胞的试验，同传统方法相比活性稍低。
快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得Lipofectamine 2000非常适用于96孔板的高通量转染，比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。
适用细胞株范围不同的转染试剂所适用的细胞株范围各不相同。
一个实验室常常会用到不止一种细胞株，甚至是比较特殊的细胞株。
一个转染试剂所适用的细胞株越多，当然越受用户的欢迎。
根据Invotrogen网站的资料，Lipofectamine 2000已经证实可用于高达517种细胞株，覆盖了相当广的范围。
要看看Lipofectamine 2000是否适用于你现有的细胞株，可以访问以下Invitrogen网址（/content.cfm?pageID=9559&fuseaction=CellLi nes.dsp_searchRange）适用的核酸类型和DNA大小有的转染试剂是为siRNA转染而设计的，有的则是为DNA转染设计。
Lipofectamine 2000可以适用于包括DNA，siRNA, dsRNA, 荧光标记的Oligo, RNA等在内的核酸转染，这使得Lipofectamine 2000适用范围非常广泛，无论是基因表达分析的DNA转染，或者是RNAi，Lipofectamine 2000都能胜任，这样你就不需要为不同目的购买不同试剂了。
值得注意的是，最常用的DNA转染中有一个DNA大小的问题，太大的质粒不那么好转。
我们暂时还没有找到Lipofectamine 2000相应的资料。
用量和价格好东西往往不便宜。
可是在实验室中，价格往往是最具有杀伤力的。
Lipofectamine 2000用的剂量大吗？价格如何？根据说明书，24孔板转染每次用2ul左右，1.5ml Lipofectamine 2000大约可做750次24孔板转染，或者大约150次6孔板转染，而1.5ml Lipofectamine 2000当前市场价格4667元，0.75ml 价格是2798元（可以磨到多少折扣就要看你的侃价功力了）。
平均下来，再算上折扣，Lipofectamine 2000性价比还是挺高的。
注意事项 Lipofectamine 2000要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响。
Lipofectamine 2000可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基，使得操作方便了许多，但是要注意制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。
复合物形成后是可以加入血清。
这里要特别注意检测所用的无血清培养基是否能和Lipofectamine 2000匹配，比如已知CD293, SFM II, VP-SFM 就不行。
此外还应该留意，如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者时细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密较低的转染试剂，不适合用 Lipofectamine 2000。
对于大多数阳离子脂质体试剂，应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。
DNA和转染试剂的比例，通常推荐是1:2或者1:3，优化可以从0.5-5之间慢慢试。
使用小剂量确定的优化条件可以用于进行大剂量的转染，只要根据培养板表面比例线性增加铺板细胞的数目、阳离子脂质体试剂和DNA量就可以了。
还有转染的时候培养基中不能添加抗生素。
抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。
这降低了细胞的活性，导致转染效率低。
所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
这样，在转染前就不必润洗细胞。
对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。
另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。
阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。
当然还有要注意质粒的质量，质粒的内毒素是转染的大敌，Invitrogen自然是大力推荐自家的质粒纯化产品啦，这个嘛，看看生物通前面的质粒纯化专题有特别介绍就好啦。
二、今年的新产品：Lipofectamine 2000 CD 和 Optifect作为一个新产品，Lipofectamine 2000 CD当然应该有区别于原来的Lipofectamine 2000。
这个1ml就要卖到5000多块的新产品好在哪里？主要是由于不采用动物来源的材料，可以满足某些特殊要求，比如要求不含动物来源材料等。
其他优缺点和Lipofectamine 2000差不多。
以24孔板计算，一次2ul,1ml 足够500次转染，但价格不便宜，要5000多元。
Optifect 主要是为在较低铺板密度条件下转染而设计的，比如细胞增埴相关基因和细胞周期相关基因的表达和研究往往要求较长的表达周期，细胞表面蛋白的表达和研究、还有部分高通量筛选等等也要求在较低铺板密度条件下转染，由于Lipofectamine 2000要求转染时90－95％汇片而不太适合，Optifect就是一个选择。
Optifect最佳的铺板密度是30％-70%，其他的操作和注意事项也和Lipofectamine 2000相近。
同样可以直接加入细胞培养物中，转染前后都不需要更换血清，同样不要加抗生素，等等。
1ml价格是3616，用量相对高一些，24孔板一次需要3－4ul，6孔板就要用到15－24ul/次，每次算下来就比前面的贵了。
三、闻道有先后，术业有专攻，Invitrogen的其他几个当家花旦LIPOFECTAMINE PLUS：是老版LIPOFECTAMINE的改良版。
加入PLUS试剂后会导致在广泛条件下的高活性，不需要进行细节优化就可以进行高活性转染了。
实验步骤同样很简单，细胞铺板密度以转染当天汇合度至70%到90%为宜。
DMRIE-C 转染悬浮细胞效率最高，如Jurkat细胞以及其他淋巴细胞来源的细胞系。
也可以用来转染摇瓶中使用CD CHO培养基培养的悬浮CHO细胞，易于放大。
另外建议用DMRIE-C将RNA转染入贴壁细胞。
它比使用LIPOFECTIN转染RNA至BHK-21细胞的表达水平高。
CELLFECTIN 转染昆虫细胞的首选，特别是于昆虫基因表达中生产杆状病毒的Sf9和Sf21细胞以及果蝇细胞。
LIPOFECTIN 已经成功用于人类和非人类内皮细胞的瞬时转染。
除了质粒DNA转染外，使用LIPOFECTIN也可以将RNA，寡聚核苷酸，酵母人工染色体和蛋白转入多种细胞系。
四、阳离子转染试剂的一些注意事项（Invitrogen提供）有血清时的转染：血清一度曾被认为会降低转染效率，但只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。
阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。
对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEMⅠ培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。
对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。
培养基中的抗生素：抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。
这降低了细胞的活性，导致转染效率低。
所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。