RNA、DNA和Protein纯化操作步骤

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单克隆抗体纯化工艺流程

单克隆抗体纯化工艺流程

单克隆抗体纯化工艺流程
单克隆抗体纯化工艺流程是一个复杂且精细的过程,主要涉及到细胞发酵培养后的处理以及后续的纯化步骤。

以下是对这一工艺流程的详细解释。

首先,在细胞发酵培养结束后,会采用深层过滤或连续流离心深层过滤的方法来去除发酵液中的细胞及细胞碎片。

这一步是至关重要的,因为它能有效地去除杂质,为后续纯化步骤提供高质量的上清液。

接着,上清液会进入纯化工艺。

整个纯化工艺主要包括ProteinA亲和色谱、低PH病毒灭活、阴/阳离子交换色谱(或复合模式色谱)、除病毒过滤、超滤浓缩换液以及除菌过滤等步骤。

在ProteinA亲和色谱步骤中,利用抗体结构中的Fc区域能特异性结合色谱填料偶联配基ProteinA蛋白的特性,进行色谱分离。

大部分杂蛋白等杂质因无法与色谱填料结合而流穿,而抗体则与ProteinA蛋白结合,随后以低PH溶液洗脱柱子,收集粗纯后的抗体,达到初步纯化的效果。

随后,阴离子交换色谱利用等电点的差异进行分离。

病毒、HCP、DNA等杂质因PI相对较低,呈酸性,在较高PH条件下与填料结合,而抗体PI一般相对较高,呈碱性,直接流穿,从而达到进一步分离去除杂质的效果。

除病毒过滤则采用特定规格的滤膜,如20nm左右的滤膜,进行纳滤,截留病毒颗粒,而蛋白则顺利流穿,从而实现病毒的去除。

最后,经过超滤浓缩换液和除菌过滤步骤,即可获得高质量的抗体原液。

这些步骤确保了抗体的纯度、活性和安全性,为后续的应用提供了保障。

整个单克隆抗体纯化工艺流程虽然复杂,但每一步都至关重要,不可或缺。

它充分展示了现代生物技术的精细和高效,为抗体药物的研发和生产提供了坚实的基础。

RNA提取纯化

RNA提取纯化

准备工作:(严格的去RNA酶条件)器材:去RNA酶的15ml离心管、1.5mlEP管、PCR的EP管、蓝黄白枪头,专用移液枪,500ml 试剂瓶*4,高压灭菌锅,4°离心机,振荡器。

试剂:苯酚,氯仿,异丙醇,无水乙醇,去RNA酶水、,DEPC, Trizol裂解液,双氧水,50*TAE,RNA酶抑制剂,DNA酶,3mol/L乙酸钠(pH5.2),10*纯化buffer,终止buffer,琼脂糖凝胶粉末,Loading buffer(+EB的预染buffer)。

1、15ml离心管分装10ml的氯仿,异丙醇,无水乙醇,用去RNA酶水配制75%乙醇。

分装1ml去RNA酶水。

2、500ml试剂瓶加500ml去离子水,500ml试剂瓶加50*TAE10ml用去离子水定容到500ml,每瓶加DEPC(终浓度为0.01%,有毒,未高压灭菌前要小心),剧烈振荡混匀放置24小时后高压灭菌(降解DEPC)。

3、用DEPC处理过的水配制终浓度为3%的双氧水500ml(泡电泳槽,配胶板,锥心瓶用)。

RNA提取:1、准备去RNA酶的ep管,写好标签。

2、洗净6孔板中的液体,用移液枪每孔加1mlPBS洗涤一次。

3、用枪吸尽PBS,每孔加入1ml Trizol (有毒,最好通风橱里面加)裂解液(根据培养细胞孔的面积加入裂解液,6孔板加1ml即可),轻轻摇晃5min左右。

4、用1ml的枪吹打细胞,使其充分脱离6孔板,将液体吸入准备好的ep管中(如果打算以后再做可放入-80°冰箱保存)。

5、每管加入200ul氯仿(1ml加200ul),振荡使其充分混匀,冰上静置10min,这时可以预冷4°离心机。

(如果是从-80°冰箱拿出的样品需待样品溶解后振荡混匀,室温平衡5min再进行该步骤)6、4°离心机14000g离心15min。

此时准备新的ep管,每管加500ul异丙醇。

7、将上清转移至准备的ep管中(不要吸到下层液体),混匀后放入-20°冰箱30min。

DNA和RNA的提取与纯化

DNA和RNA的提取与纯化

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4.苯酚抽提法 苯酚作为蛋白变性剂,同时可抑制DNA 酶的降解作用。 苯酚处理后,蛋白质分子溶于酚相,而DNA 溶于水相, 离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并水相,用 乙醇沉淀DNA.
5.水抽提法 利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐 溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA 充分溶解 于水中,离心后收集上清液,在上清中加入NaCl调节至 2.6 mol/L,加入2倍体积的95%乙醇,立即用搅拌法搅出, 然后用不同浓度的乙醇洗涤。空气干燥。
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不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方 法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及 所含的成分不同,分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的 DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可 用的DNA大分子。
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(一)DNA提取的基本原理
DNA分子是极离太更易溶于水。 酸性溶液中,DNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
生物细胞中大部分DNA集中在细胞核,多以脱氧核糖核蛋白 (DNP)形式存在。而DNP在盐溶液中的溶解度受盐溶液浓度 的显著影响,0.14 mol/L NaCl溶液中最低,仅为水中溶解度 的1%,浓度升高,溶解度增加,到1 mol/L时,比纯水高2倍。 而核糖核蛋白(RNP)在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小, 在0.14 mol/L NaCl的溶解度较大。据此,可分享DNP和RNP.
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2. 天然DNA的来源和用途
天然DNA包括染色体DNA,病毒DNA(噬菌体 DNA),质粒DNA,线粒体及叶绿体DNA等,可从不 同的生物体中提取.
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•染色体DNA.原核和真核生物均含有染色体DNA. 其分子巨大,可长达106kb,小的也有1000kb左右.是生物界

DNA、RNA、蛋白质提取

DNA、RNA、蛋白质提取

1、菌体破碎液氮充分研磨,转入离心管中,加入1 ml Biozol 试剂,振荡混匀,室温孵育10 min( 如不立即提取,样品可在Biozol 试剂中4℃保存) 。

加入200 μl 氯仿,振荡混匀后在冰上孵育10 min,然后4 ℃、12 000 r /min 离心15 min。

离心后样品分为3 层,底层为蓝色有机相,上层为无色水相和中间层。

2、RNA 的提取。

将上层转移到1. 5 ml 离心管中,加入等体积异丙醇,颠倒混匀,将混合样品于-20 ℃孵育20min 以上,然后4 ℃、12 000 r /min 离心10 min。

RNA 沉淀通常形成片状沉淀附着于管壁和管底; 小心弃上清,用1 ml75%乙醇洗涤RNA 沉淀1 次,颠倒洗涤离心管管壁,尽可能让沉淀悬浮,然后4 ℃、12 000 r /min 离心5 min,再次去除上清; 适度干燥RNA 沉淀,用适量( 一般为20-50 μl) 无RNA酶水或TE 溶液来溶解RNA。

3、DNA 的提取。

DNA 的分离是CTAB 法的融合改进。

移去上层后,其余部分加入1.5 ml 无水乙醇,颠倒混匀后室温静置5 min,然后4 ℃、2000 r /min 离心5 min。

上清转移至新的1.5 ml 离心管中用于提取蛋白质,沉淀用于提取DNA。

沉淀加入700 μl 65 ℃预热的CTAB 抽提液[1.5% CTAB( W/V) ,0.1 mol /L Tris-HCl,20 mol /L EDTA,1.4 mol /L NaCl,pH 值8.0,用前加入β-巯基乙醇至终浓度为2%( V/V) ],颠倒混匀,65 ℃水浴1 h 以上; 加入等体积的氯仿/异戊醇( 24:1,V/V) ,颠倒混匀,4 ℃、10000 r /min 离心10min; 取上清,加入等体积的异丙醇,-20℃放置30 min,4℃、12000 r /min离心15 min; 弃上清,用1 ml 75% 乙醇溶液洗涤沉淀,4℃、12 000 r /min 离心5 min,弃上清。

原核生物合成蛋白质的过程

原核生物合成蛋白质的过程

原核生物合成蛋白质的过程1. 转录(Transcription)转录是合成蛋白质的第一步。

在转录中,DNA的一部分被复制成RNA,这个过程由RNA聚合酶酶催化。

RNA聚合酶移动到DNA的启动子区域,并开始合成RNA分子,RNA的合成是通过读取DNA的编码序列而进行的。

RNA聚合酶根据DNA模板的信息合成RNA分子的互补链。

2. 剪接(Splicing)在许多原核生物中,合成的RNA分子是在剪接过程中进一步修饰的。

剪接是将原始RNA分子中的内含子部分剪除并将外显子部分连接起来的过程。

这样产生的成熟mRNA分子中只包含编码蛋白质所需的信息。

3. 反义译码(Translation)在细胞的质粒中,mRNA进入细胞质,利用核糖体和tRNA进行翻译。

翻译过程中,tRNA将氨基酸输送到适当的位置,该位置是由mRNA上的密码子确定的。

这个过程由rRNA(核糖体上的RNA)和其他蛋白质组成的核糖体催化。

4. 合成蛋白质(Protein Synthesis)在合成蛋白质的过程中,翻译复合物逐个读取mRNA上的密码子,并根据密码子的信息合成相应的氨基酸链。

这个氨基酸链最终形成蛋白质的主链。

每个氨基酸都通过肽键连接到前一个氨基酸,形成一个多肽链。

当翻译达到终止密码子时,翻译过程停止,多肽链被释放。

5. 后转录修饰(Post-translational Modifications)合成蛋白质后,它们可能需要进一步修饰,以获得其最终功能。

这些修饰可以包括磷酸化,甲基化,脂肪酰化等。

后转录修饰通过各种酶和辅酶进行催化。

总结起来,原核生物合成蛋白质包括转录、剪接、反义译码、合成蛋白质和后转录修饰等步骤。

这些过程是高度协调的,且需要多种分子和酶的参与。

在这个过程中,DNA的基因信息被转录成RNA,并且通过翻译过程合成蛋白质。

在合成过程中,还需要剪接和后转录修饰等步骤来增强蛋白质的功能。

总的来说,原核生物合成蛋白质的过程是一个非常复杂而又精确的生物学过程。

从酵液中分离纯化蛋白质等胞内产物的一般流程

从酵液中分离纯化蛋白质等胞内产物的一般流程

从酵液中分离纯化蛋白质等胞内产物的一般流程包括以下步骤:
1. 预处理:采用加热、调整pH、絮凝等措施和单元操作改变发酵液的理化性质,为固液分离作准备。

2. 固液分离:采用珠磨、匀浆、酶溶、过滤、离心等单元操作除去固相,获得包含目的产物的液相,供进一步分离纯化用。

3. 初步纯化:采用萃取、吸附、沉淀、离心等单元操作,将目的成分与大部分杂质分离开来。

4. 精细纯化:采用层析、电泳、分子蒸馏等单元操作,将目的成分与杂质进一步分离,使产物达到预期标准。

5. 成品加工:采用结晶、浓缩、干燥等单元操作,将目的产物加工成适应市场需要的商品。

以上流程仅供参考,具体操作可能会因实际情况而有所不同。

蛋白纯化技术路线

蛋白纯化技术路线

蛋白纯化技术路线
1.寻找来源:确定需要纯化的蛋白质所在的生物样品,可以是细胞提取物、细菌发酵液、动物组织等。

2.预处理:对样品进行预处理来去除非目标蛋白质和杂质,使目标蛋白更容易纯化。

常见的预处理方法包括超声破碎、离心、滤过等。

3.亲和层析:使用亲和层析柱选择性地结合目标蛋白质。

亲和层析柱可以根据目标蛋白质的性质选择,例如亲和剂可以是金属离子、抗体、某种结构域等。

目标蛋白质被结合到柱子上后,其他非目标蛋白质可以通过洗脱步骤洗脱下来。

4.尺寸排阻层析:利用蛋白质的分子量差异进行分离。

此步骤常用于去除亲和层析步骤中残留的杂质和非目标蛋白质。

5.离子交换层析:利用蛋白质在不同离子浓度条件下的电荷差异来实现分离。

在正负电荷基质之间的交换,可以根据蛋白质的电荷特性进行选择性结合和洗脱。

6.亲水性层析:利用蛋白质的亲水性差异进行分离。

亲水性层析可以通过调整盐浓度和pH值来选择性结合和洗脱目标蛋白质。

7.透析:用于去除层析步骤中使用的缓冲剂、杂质与目标蛋白之间的物质交换。

8.浓缩:用于将目标蛋白溶液浓缩至适当的浓度,以便于后续的研究操作。

9.纯化效果验证:使用蛋白质分析方法(如SDSPAGE、Westernblot等)来验证纯化的效果和目标蛋白质的纯度。

简述核酸分离纯化的主要步骤。

简述核酸分离纯化的主要步骤。

简述核酸分离纯化的主要步骤。

大家好,今天我们来聊聊核酸分离纯化这件事。

说到这个话题,很多人可能会觉得这就像是从泥巴里找金子,难得不得了,但其实只要掌握了步骤,简直就像是在玩一场化学版的捉迷藏。

核酸分离纯化是为了从各种样本中提取出我们的DNA或RNA,并且把它们从其他杂质中清理出来。

要做到这一点,我们得一步步来,每一步都不容马虎。

接下来,就让我带大家一起走进这个过程,看看如何让这些细小的分子从一堆混乱中脱颖而出。

2. 主要步骤详解2.1 样本准备首先,咱们得从头开始,准备好样本。

想象一下,我们要从一杯混合果汁中找出果肉,首先就得把这杯果汁倒进一个干净的容器里。

具体来说,我们通常会从细胞中提取核酸,所以需要将细胞破碎以释放出核酸。

这个过程就像是在打开一罐罐头,一切都要小心翼翼。

为了让细胞破裂,我们会用到一些化学试剂或者物理方法,比如用研磨机或者超声波处理。

就像是把一个充满秘密的小盒子打开,里面的核酸就这样被释放了出来。

2.2 核酸提取一旦细胞被破坏,释放出的核酸就是我们接下来要处理的对象。

这时候我们需要把这些核酸从其他杂质中分离出来。

这个步骤就像是在海滩上捡贝壳,我们需要把那些不起眼的沙子和海藻去掉,剩下的才是我们真正想要的。

核酸提取的方法有很多,比如利用试剂盒或者化学溶液。

常见的有酚氯仿提取法和柱纯化法。

酚氯仿法就像是用一招老派的武功,把核酸和蛋白质分开,而柱纯化法则像是用现代化的设备,让核酸在特定的柱子上游刃有余地被吸附下来。

2.3 核酸纯化好啦,提取出核酸之后,接下来就是纯化了。

纯化这一步,就像是用细网筛选掉杂质,只留下最珍贵的部分。

我们通常会使用一些化学试剂来清洗掉剩余的杂质,比如盐、酒精等。

这个过程有点像给你的衣服做干洗,把那些不干净的部分都清理干净。

纯化的目的是为了确保你得到的核酸足够干净,以便后续的实验能顺利进行。

3. 检测与保存3.1 检测最后一步,我们得检测一下核酸的质量,看看它是不是达到了要求。

DNA、RNA和蛋白质的生物合成

DNA、RNA和蛋白质的生物合成

13. 连接酶
14. 单链结合蛋白
15. 拓扑异构酶
16. DNA的复制
逆转录
1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚 合酶,该酶以RNA为模板,根据碱基配对原则,按照RNA的 核苷酸顺序(其中U与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传 信息流转录的方向相反,故称为反转录。
甲酰甲硫氨酰-tRNA的合成
甲酰FH4
甲酰基转移酶
甲酰甲硫 氨酰tRNAf
原核生物起始复合物的生成 mRNA-30S-IF3-IF1复合物
↓ 30S起始复合物 (30S-mRNA-fMet-tRNAf-GTP-IF1-IF2)
↓t-tRNAf )
真核生物翻译起始的特点
转录过程
不对称转录:在DNA的两条多核苷酸链中只有其中一 条链作为模板,这条链叫做模板链(template strand)。 DNA双链中另一条不做为模板的链叫做编 码链。
RNA的复制
在某些不含DNA,只含RNA的病毒和噬菌体中,其 RNA既是遗传信息载体,又是信使,在感染寄主时, 本身要复制。
1. 核蛋白体是80S (40S + 60S) 2. 起始因子种类多 3. 起始tRNA的Met不需甲酰化 4. 帽子结合蛋白(CBP)促使mRNA与核蛋
白体小亚基结合 5. 起始tRNA先与核蛋白体小亚基结合,
然后再结合mRNA
3.肽链的延长
又称核蛋白体循环 (ribosomal cycle), 每次循环包括: 进位(entrance) 成肽(peptide bond formation) 移位(translocation)
1953年,Watson和Crick在DNA双螺旋 结构的基础上提出了半保留复制假说:

蛋白质纯化工艺

蛋白质纯化工艺

蛋白质纯化工艺蛋白质纯化是生物工程学重要的研究和应用基础。

蛋白质纯化包括质量和生物活性的筛选,在各种体系中短暂的保存与防止变性与失活,滤纯,再分离,活性评价,最后进行其化学组成分析和蛋白质结构分析等。

蛋白质纯化技术是分子生物学研究和药物开发的重要步骤,也是生物活性物质的制备技术,其正确的应用将决定检测或研究的成败。

蛋白质纯化工艺主要包括以下步骤:粗纯化、活性筛选、精纯化、储存保护、测定纯度、稳定性研究、活性评价、结构分析及分子变异研究等。

1、粗纯化粗纯化是蛋白质纯化的第一步,是从复杂的细胞、组织和体液等中分离出质量较高的蛋白质的步骤。

精确的粗纯化是实际纯化步骤的关键,可以减少后面精纯的步骤数量,从而减少纯化的时间和成本,提高纯化效率。

粗纯化的能否实现良好极大程度上取决于蛋白质的组成,它的特性密切相关于技术的选择,一般采用分离技术和催化材料结合在一起,以便相容性的反应释放蛋白质。

2、活性筛选活性筛选是一种重要的技术,它可提供有关活性的相关信息,重要的是评估蛋白质的生物活性,这 requires a complex set of assays to identify and understand the activity of a protein. 常用的活性筛选技术有:ELISA(酶联免疫吸附测定)、流式细胞术(FACS)、定量PCR(qPCR)、酶联免疫检测(ELISPOT)、荧光免疫检测(FITC)、定量蛋白印迹(WB)、定量琼脂糖凝胶电泳(SDS-PAGE)、RNA 组学(RNA-Seq)和细胞形态学等。

3、精纯化精纯化是蛋白质纯化工艺中最重要的一步,它是将有效的活性蛋白质从其它杂质物质中分离出来的过程,其基本步骤有:蛋白质浓缩、抽提、沉淀、结合、柱层析、交换性结合、膜分离、离心等。

精纯化的方法实际上也是一种分离技术,它是利用物理性质的差异分离和抽提蛋白质,包含了层析法和属性法两种分离方式。

proteina纯化抗体原理步骤 解离缓冲液

proteina纯化抗体原理步骤 解离缓冲液

proteina纯化抗体原理步骤解离缓冲液嘿,咱今儿个就来讲讲 proteinA 纯化抗体的那些事儿,还有解离缓冲液是咋起作用的哈!你知道不,这 proteinA 就像是个神奇的小魔术贴,专门能和抗体紧紧地黏在一起。

想象一下,抗体就像是个调皮的小孩,到处乱跑,而proteinA 呢,就是那个能一把抓住小孩的厉害角色。

那具体是咋纯化的呢?首先呀,咱得把含有抗体的混合物准备好,这就好比是一堆混杂着各种宝贝的大箱子。

然后呢,把 proteinA 这个神奇的“魔术贴”放进去。

嘿,这时候奇迹就发生啦,抗体就会乖乖地被 proteinA 给抓住,就像小孩被抓住了小手一样。

接下来,就是要把抓住抗体的 proteinA 给分离出来啦。

这可不容易哦,就好像要从一堆杂物里把那个黏着宝贝的魔术贴给挑出来一样。

不过咱有办法呀,通过一些特定的手段,就能把它们给弄出来啦。

再来说说这解离缓冲液。

你想想看,抗体被 proteinA 抓住了,咱得想办法让它们松开呀,对吧?这解离缓冲液就像是一把神奇的钥匙,能把这个“黏合”给打开。

它就像是个温柔的劝架人,能让抗体和proteinA 和平地分开。

咱用解离缓冲液的时候,就像是给它们施了个魔法,让抗体从proteinA 上慢慢地滑落下来。

这过程可神奇了,就好像是看着一朵花慢慢绽放一样。

你说这是不是很有意思呀?咱通过这么一系列的操作,就能把纯净的抗体给弄出来啦!这可是在生物学研究、医学检测等好多领域都超级重要的呢!纯化抗体可不是一件简单的事儿哦,每一步都得小心翼翼的,就像走钢丝一样。

但只要咱掌握了这些原理和步骤,再加上解离缓冲液这个好帮手,那还不是手到擒来呀!所以呀,咱可得好好记住这些,以后说不定啥时候就用上了呢。

总之呢,proteinA 纯化抗体和解离缓冲液那可是一对好搭档,它们相互配合,就能为我们带来纯净的抗体,为科学研究和实际应用立下汗马功劳呢!你现在是不是对它们有了更深的了解呀?。

从样品中同时分离DNA和RNA

从样品中同时分离DNA和RNA

鸡肝 鸡肾 鸡脾 鸡肺
0.1493 0.137
0.5159 0.4116 0.1934 0.2502 0.1208 0.1279
1.96 1.96 1.94 1.94
1.9 2.13 1.89
2.1
260/230
1.98 1.72 2.41 2.47 1.27 2.18 1.85 1.74
0.55 0.44 1.44 1.78
AllPure Fibrous DNA/RNA Kit 进行提取。提取后取 1ug 的总 RNA 用 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析,取 5%基因组 DNA 用 0.8%琼脂糖 凝胶电泳析结果(结果如下)。由电泳图可知,使用试剂盒得到的
RNA 不降解,得到的 DNA 片段完整,无拖尾现象。Lambda DNA/Hind III Marker 表明,得一的 DNA 片段在 23KB 左右。
2.91 2.06 12.99 12.29 6.85 6.25
( Genomic DNA )
(Total RNA)
取纯化的 NaNodrop 2000 进行分析(结果以下)。Nanodrop
2000 的数据分析结果,使用该方法得到的 DNA 和 RNA 纯度高,
可适合于各种下游应用。
样品
浓度 µg/µl
样品类型 动物软组织和细胞 动物软组织和细胞 动物软组织和细胞
难裂解组织样品 石蜡包埋组织样品
植物样品 动物软组织和细胞 动物软组织和细胞
培养细胞
AllPure Kits 20 分钟
15 分钟,即用 30 分钟 50 分钟
安全,无毒 高,A260/280>1.9 高,A260/280=1.8
好,20-60kb 中
与 Trizol 的性能相比

抗体ProteinA纯化方法

抗体ProteinA纯化方法

抗体ProteinA纯化一.P roteinA柱子的制备1.配制溶液;结合/洗涤缓冲液:NaCl,0.5M ;Na2HPO4,20mM ;PH8.0。

配制500ml的方法:称取NaCl 4.383g,Na2HPO43.5814g溶解于450ml的双蒸水中。

调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。

2. 制备空柱子(1)先打开用过的PD-10上盖,拿掉上面的盖膜。

盖上盖子,摇晃,倒去里面的填料,用PBS清洗3次。

(2)用胶带固定好PD-10空柱子,要求垂直放置。

(3)在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。

(4)ProteinA填料混匀,(10ml包装一小瓶)。

(5)加入5ml的ProteinA到柱子中。

(6)(7)(8)二.纯化步骤1.样品准备;将兔血清与结合缓冲液1:1混合,过滤(防止堵塞柱子)。

2.平衡柱子:用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。

3.上样:将准备好的血清样品上样,根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。

4.洗脱杂蛋白:用结合缓冲液冲洗柱子,直至结合液中不含蛋白。

5.收集抗体:用洗脱液过柱,同时收集漏出液(约3-4ml/管),直至漏出液中不含蛋白。

测定各收集管中的蛋白含量,合并蛋白管。

(注意:收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液,防止抗体在过酸的环境下失活)6.柱子再生:用5-10倍体积的再生液再生柱子。

7.PBS透析收集的抗体。

三.试剂的制备1. 结合缓冲液1000ml 500ml甘氨酸112.6g 56.3g氯化钠175.2g 87.6g氢氧化钠调PH至9.02. 洗脱缓冲液500ml甘氨酸7.507g用盐酸调PH至3.03. 再生缓冲液500ml甘氨酸7.507g酸调PH至2.04.称取12.1gTris碱,加80毫升的双蒸水,溶解后用盐酸调节PH8.0,补加到水100毫升,。

rna纯化原理

rna纯化原理

rna纯化原理
RNA纯化是一种重要的实验步骤,目的是从混合样品中分离、纯化并富集RNA。

在进行RNA纯化的过程中,需要考虑到RNA的稳定性以及杂质的去除。

以下是一些常用的RNA纯化
方法和原理:
1. 酚/氯仿法:该方法利用RNA和DNA在酚相和水相中的差
异分配特性,将细胞裂解后的混合样品经酚酸盐处理,使
RNA富集在酚相中,而DNA和蛋白质则富集在水相中。

2. 硅胶柱层析法:该方法基于RNA与硅胶之间的结合性质,
通过将样品溶液滴入硅胶柱中,RNA会与硅胶发生结合,然
后通过洗脱步骤来去除杂质,最终得到纯化的RNA。

3. 离心过滤法(Ultrafiltration):该方法利用超滤膜的孔径大
小来分离RNA和其他分子。

样品置于超滤膜中,通过离心加
速运动,分子会根据其大小通过膜孔,使得RNA被保留在滤
膜上,从而实现纯化。

4. 核酸磁珠法:该方法利用具有亲和性的磁珠来捕获RNA分子,然后通过磁场将磁珠与复合物分离出来,并进行洗脱步骤来去除杂质,使得RNA得到纯化。

这些方法各有优缺点,需要根据实验需求和样品特性选择最合适的方法进行RNA纯化。

在实验过程中,需要注意避免RNA 的降解,避免污染以及误差的引入,以确保最终纯化的RNA
质量和纯度的高度。

dna提取纯化流程

dna提取纯化流程

dna提取纯化流程英文回答:DNA Extraction and Purification Protocol.Materials:Biological sample (e.g., blood, saliva, tissue)。

Lysis buffer.Proteinase K.RNase A.Phenol-chloroform.Chloroform.Isopropanol.Absolute ethanol.TE buffer.Procedure:1. Lysis: Lyse the biological sample in a lysis buffer containing detergents and proteinase K to break down the cell membrane and release the DNA.2. Protein Digestion: Add RNase A to digest RNA and prevent contamination.3. Phenol-Chloroform Extraction: Extract the DNA from the lysed sample by repeated extraction with a phenol-chloroform mixture. Phenol denatures proteins, while chloroform separates the organic and aqueous phases.4. Chloroform Extraction: Further extract the DNA from the aqueous phase with chloroform to remove residual proteins and lipids.5. Isopropanol Precipitation: Precipitate the DNA from the aqueous phase by adding isopropanol and chilling.6. Centrifugation: Centrifuge the mixture to pellet the precipitated DNA.7. Ethanol Wash: Wash the DNA pellet with absolute ethanol to remove salts and other impurities.8. Centrifugation: Centrifuge again to pellet the DNA.9. Resuspension: Resuspend the DNA in TE buffer for storage or further analysis.中文回答:DNA提取纯化流程。

柱回收纯化mrna

柱回收纯化mrna

柱回收纯化mrna
柱回收纯化 mRNA 是一种常见的分子生物学技术,用于从细胞
提取的总RNA 中纯化出 messenger RNA(mRNA)。

这种技术通常包
括以下步骤:
1. 细胞破碎,首先需要将细胞破碎,以释放细胞内的 RNA。


可以通过细胞裂解缓冲液和机械破碎或者化学方法来实现。

2. 总RNA提取,接下来,使用一种适当的方法(例如酚/氯仿
提取或者商业化的RNA提取试剂盒)来提取总RNA,其中包括 rRNA、tRNA 和 mRNA。

3. mRNA 纯化,接下来,使用柱回收纯化技术来纯化 mRNA。


通常涉及将总RNA 样品加入到含有多聚T寡核苷酸的柱子中,然后
通过离心或者真空吸滤的方式,使 mRNA 与柱子结合,而 rRNA 和tRNA 等其他 RNA 分子则被去除。

4. 洗脱 mRNA,经过柱回收后,mRNA 会与柱子结合,接下来需
要用洗脱缓冲液将 mRNA 从柱子上洗脱下来,以得到纯化的 mRNA
样品。

柱回收纯化 mRNA 的优点在于可以高效地从总RNA 样品中富集mRNA,减少 rRNA 和 tRNA 的干扰。

这种技术在分子生物学研究中广泛应用,例如在转录组学研究中,用于分析细胞中的基因表达水平。

同时,柱回收纯化 mRNA 的过程需要严格控制实验条件,以确保纯化得到的 mRNA 样品质量和纯度,避免外源性污染的引入。

在实际操作中,研究人员需要根据具体的实验要求和样品特性选择合适的柱回收纯化试剂盒和操作步骤,以确保获得高质量的 mRNA 样品。

用Trizol提取DNA,RNA及蛋白质的方法及注意事项

用Trizol提取DNA,RNA及蛋白质的方法及注意事项

TRIZOL试剂警告:接触皮肤或误吞将导致中毒或灼伤。

接触皮肤之后立即用去垢剂和水冲洗。

若感到不适,请遵医嘱(可能的话出示标签)。

收到药品后,在室温下存储。

以已证明TRIZOL在常温下可稳定储存12个月。

说明:TRIZOL是一种从细胞和组织中提取总RNA的现用试剂。

该试剂是一种苯酚异硫氰酸酯单相溶液,它发展自Chomczynski 和Sacchi的RNA一步抽提法。

在细胞破碎和溶解细胞组分时,TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。

离心后加入氯仿,将溶液分为水相和有机相。

RNA只留在水相中。

转移水相后,用异丙醇沉淀回收RNA。

除去水相后,样品中的DNA和蛋白质也可以用后续沉淀方法回收。

用乙醇从相界面间沉淀DNA,异丙醇从有机相回收蛋白质。

DNA 的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有用。

这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各种量的组织(低至50-100mg,高至≥1g)和细胞(低至5×106,高至>107)都有良好的效果。

其简单的操作方法允许同时处理大量样品。

整个过程可在1小时内完成。

用TRIZOL提出的总RNA 不含蛋白质和DNA污染,可用来做Northern 电泳分析、斑点杂交、poly (A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。

在PCR和扩大DNA酶Ⅰ梯度分离中,建议使用一个内含子中的两个引物。

TRIZOL简化了各种类型的大分子及小分子RNA的分离。

例如,从鼠肝分离的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,显示出介于7到15kb的大分子RNA 条带,(由mRNA和hnRNA组成的)两个约5kb(28S)和2kb(18S)核糖体RNA 的条带,以及介于0.1到0.3kb(tRNA, 5S)的小分子RNA的条带。

所分离的RNA 稀释于TE时A260/A280之比大于等于1.8。

谨防RNase的污染:在提取中任何不正确的操作方法中都可能偶然引入RNase。

由于其活性难以抑制,因此只能直接避免其引入。

rna纯化方法

rna纯化方法

rna纯化方法
嘿,咱今儿就来聊聊 RNA 纯化这档子事儿!RNA 啊,就像是生物
世界里的小精灵,可重要着呢!要想好好研究它,纯化可不能马虎。

想象一下,RNA 就像是混在一堆杂物里的宝贝,咱得想办法把它
挑出来,还不能伤着它。

那怎么纯化呢?
一种常见的方法就是用专门的试剂盒。

这就好比是给 RNA 准备了
一个专属的“魔法盒子”,里面有各种神奇的试剂和工具。

把含有 RNA
的样本放进去,经过一系列的操作,就能把 RNA 给分离出来啦!就像
在沙堆里淘出金子一样。

还有离心法呢!把样本放在离心机里呼呼转起来,不同的成分就会
因为重量的不同而分层,RNA 就会乖乖地待在它该在的地方。

这离心
法啊,就像个大力士,把各种东西分得清清楚楚。

沉淀法也不错哦!通过加入特定的试剂,让 RNA 沉淀下来,然后
把其他杂质给甩掉。

这就好像是在浑水里加点东西,让宝贝沉淀到水底,上面的脏东西就可以倒掉啦。

在进行 RNA 纯化的时候,可得注意一些小细节哟!比如操作环境
要干净,不能有其他乱七八糟的东西来干扰。

不然 RNA 小精灵可不高
兴啦!而且,使用的试剂也要质量好,不然怎么能保证纯化的效果呢?
咱再说说纯化后的 RNA 吧,那可是要好好保存的。

就像珍贵的珠宝,得放在合适的地方。

一般会放在低温环境下,让它能安安稳稳的。

总之,RNA 纯化可不是一件简单的事儿,但只要咱掌握了方法,
细心操作,就一定能把这些小精灵给纯化出来,让它们为我们的科学
研究发光发热呀!所以呀,大家可别小瞧了这 RNA 纯化,这里面的学
问大着呢!你说是不是呀?。

RNA的提取和纯化

RNA的提取和纯化

总RNA的提取时间:2013-01-05 22:32 来源:作者:生物界--------------------------------------------------------------------------------完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。

所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即1):样品细胞或组织的有效破碎;2),有效地使核蛋白复合体变性;3),对内源RNA酶的有效抑制;4)有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;5),对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。

但其中最关键的是抑制RNA酶活性。

RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径,1),提取总核酸,再用氯化锂将RNA沉淀出来;2),直接在酸性条件下抽提,酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA 留在水相。

第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失,目前该方法的使用频率已很低。

方法一:总RNA的试剂盒快速提取一些公司推出的总RNA提取试剂盒,可以用来制备咧柿康目捎糜诮 獾腞NA。

该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。

GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。

而进一步从复合体中纯化RNA,则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。

低pH 值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。

水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。

进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中,接着用异丙醇进行二次沉淀,随后用乙醇洗涤沉淀,即可去除所有残留的蛋白质和无机盐,而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。

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RNA/DNA/Protein Purification Products from MACHEREY-NAGELRNA/DNA/Protein Mini spin kitMaximum output – in one procedure NucleoSpin® TriPrepSimultaneous extraction ofTotal RNAGenomic DNATotal proteinfrom one unsplit sample MNMACHEREY-NAGEL O n e P r e p–T hr e e r e s u l t s!NucleoSpin ® TriPrepParallel isolation of RNA, DNA, and protein for most significant gene expression profilingOne Prep – Three resultsTotal RNA of superior quality – for reliable RT-PCR and all common downstream applications Genomic DNA of high purity – ready-to-use for e.g. PCR, sequencing, restriction enzyme digestion T otal protein in high recovery – directly suitable for quantification, SDS-PAGE, and Western blot analysis Rely on your experiments RNA/DNA/protein extracted from one unsplit sample – direct correlation – no variations Save your timeParallel isolation of RNA, DNA, and protein within one hourSave precious sample materialMaximum output – isolate three analytes from one sample High sensitivity – ideal for small and limited samplesProcedurehomogenizationof samplecell lysisfiltration of lysate NucleoSpin bind DNA/RNAProtein in flow-throughProtein purificationprecipitate protein (Protein Precipitator)wash protein pellet redissolve pellet in Protein Solving Buffertotal ProteinRNA purification digest residual DNA (rDNase incubation at RT)wash RNA elute RNADNA purificationwash DNA elute DNAtotal DNA DNA bound to silica membrane RNA bound to silica membrane total RNASample Material Sample Amount Lane Human cells (HeLa) 106 cells 1Mouse liver 3 mg 2Fish (Zebrafish) 1 larvae 3Plant root 100 mg 4Plant leave 100 mg 5Yeast 108 cells 6Bacteria 109 cells 7Product at-a-glanceTechnologySilica-membrane technology Sample material ≤ 5 x 106 cells≤ 30 mg human/animal tissue≤ 100 mg plant tissue Typical yield DNA ≤ 6 μg RNA ≤ 70 μgProtein ≤ 1,200 μg Typical Ratio A 260/A 280 DNA 1.7 – 1.9RNA 1.9 – 2.1 Preparation time RNA/DNA/protein ~ 60 – 75 min RNA/DNA ~ 45 minProtein ~ 35 minApplication dataRNA/DNA/protein extraction from a large variety of starting materialsRNA, DNA, and pr otein were isolated in parallel from the same source. The range of starting materialscovers tissues, cells, plant materials, yeast, and bacteria.Total DNA of high molecular weight and purity DNA was eluted in 100 μl DNA Elute buffer. A 260/A 280 ratios are in the range of 1.81 – 1.94.DNA analyzed on 1% TAE agarose gel electrophoresis*III; Fermentas), Lanes 1-7: see table belowTotal RNA of high structural integrityRNA was eluted in 50 μl RNase-free H 2O.The RNA integrity number (RIN) was measured for all mammalian samples.RIN was 9.5 for HeLa cell RNA and 8.9 for mouse liver RNA.RNA analyzed on Agilent 2100 Bioanalyzer/RNA 6000 Nano Kit*Lane L: RNA Ladder (RNA 6000 Nano Marker; Agilent), Lanes 1-7: see table belowL 1 2 3 4 5 6 7Protein Solving Buffer .The proteins are ready to use in SDS-PAGE analysis, as well as for Lane L: Protein ladder (low molecular weight marker; GE), Lanes 1-7: see table below* Figures are compiled from different gels and runs, aligned to the corresponding length markersHigh quality RNA, DNA, and proteinfrom the same sourcePerfectly suitable for gene expression profilingL 1 2 3 4 5 6 7NucleoSpin ® TriPrepOrdering informationPrepsTriPrep*10/50/250 Mini spin kit for the simultaneous isolation of total RNA, genomic DNA, and total protein from a wide variety of unsplit samples.Protein Quantification Assay50/250 RNA/Protein10/50/250 Mini spin kit for the simultaneous isolation of total RNA and Protein from unsplit samples. Including rDNAse and shredders.Mini spin columns – XS designRNA XS10/50/250 Mini spin kit for the isolation of highly concentrated total RNA from extremely small amount of starting material. Elution down to 5 μl.RNA/DNA Buffer set*100 Buffer set for the simultaneous isolation of RNA and DNA from unsplit samples. To be used in combination with NucleoSpin ® RNA II, RNA Plant, NucleoSpin ® RNA/Protein kits./bioanalysis for detailed information Your local distributor:Accurate and reliableProtein concentration down to 0.001 μg/μl Correlation coefficient of 0.97 – 1.00Protein quantification made easy!。

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