分离工程第八章

第八章 电泳
本章主要知识点
电泳的概念
电泳的基本原理 电泳技术的分类 常用的凝胶电泳技术有哪些？ 电泳装置的基本组成
聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程
SDS-PAGE电泳的基本原理及过程 琼脂糖电泳的特点及其应用
等电聚焦电泳的基本原理
双相电泳的概念及其特点
电泳的简单原理
第二节 等电点聚焦
等电点聚焦（IEF)：利用蛋白质和氨基 酸等两性电解质具有等电点，在等电点 的pH下呈电中性，不发生泳动的特点进 行电泳分离。 在电泳设备中首先调配连续的pH梯度， 然后使蛋白质在电场作用下泳动到各自 等电点的 pH区域形成具有不同等电点 的蛋白质区带。
等电聚焦原理示意图
等电聚焦技术的关键在于pH梯度的建立 载体两性电解质的概念： 作为载体两性电解质应该具有以下特点：
– 应该是两性的，使它们在分离柱中也能达到一 个平衡位置； – 应该可以作为“载体”，两性电解质不能用于
等电聚焦，只有载体两性电解质，即具有好的 导电性和好的缓冲能力的化合物才能用于等电 聚焦。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺为 支持物，制成凝胶柱。 凝胶柱由二节凝胶组成（小节浓缩胶， 大节分离胶）。这二节胶孔径大小，缓 冲液离子成分和离子强度值，电场强度 都是不同的。
样品先被压缩一个薄层，然后进行 电泳。 一般经过三个效应，浓缩效应，分 子筛效应，电荷效应，使样品分离 效果好，分辨率高。
泳动速度V(cm/s) 泳动度（迁移率） 电场强度E(伏特/cm)
缺点：电泳中因通电发热等原因而引起 的对流，常回使已分离的溶质重新混合， 为防止对流，可将电泳在多孔介质中进 行，称为区带电泳。 区带电泳：应用支持介质的电泳，它表 示在一个电场的作用下，在某一支持物 上能将一个样品组成彻底分离成若干条 区带的过程。
常规聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介质，不
仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小 与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分 子的分离，具有分子筛效应。 因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时，
在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决
工作原理
蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该 蛋白的等电点（isoelectric point pI）。 蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象， 是一个物理化学常数。 可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析
（1）自由电泳：是最早的一种电泳 形式，目前已很少使用。
瑞典管内蛋白质溶液和 缓和液间有清晰可见界 面，然后加一电场，由 于界面处存在浓度梯度 因而产生折射梯度，利 用适当的光学系统可以 观察到界面的移动。
在电泳过程中，每个移动的界面相当于 某一特定的蛋白质，通过一定计算可得 其泳动度。
SDS-PAGE 的原理
蛋白质分子的解聚 – SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试 剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠， 破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂， 如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间 的二硫键断裂。 – 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白 质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基 酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶 束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消 除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚 合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中 分子形状对迁移率的影响。
分子筛效应
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图中A，B，C均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图 分子量大小依次为MA=MB>MC，所带电荷量相同QA=QB=QC。
常用的凝胶材料：聚丙烯酰胺、琼脂糖 凝胶。 聚丙烯酰胺（丙烯酰胺）单体是神经毒 素，可积累。 凝胶电泳使用的凝胶种类和浓度根据分 离料液中溶质的相对分子质量而异。
聚丙烯酰胺含量 7. 5%凝胶 3.5%凝胶 琼脂糖或琼脂糖 与聚丙烯酰胺混合物 孔径从小到大。
适用的分子量范围 10kD~1000kD 1000kD~5000kD >5000kD
垂直电泳槽及灌胶模具
电泳的一般过程
聚丙酰胺电泳
凝胶电泳与凝胶过滤的区别
在凝胶电泳中，样品混合物中各分子的 运动速度是小分子大于大分子物质，这 种凝胶过滤中的情况恰好相反，这是因 为在凝胶电泳中，系统里没有空隙体积， 只有充满整体凝胶的网状骨架，因此在 其内部大分子物质不及小分子物质容易 移动。
载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理
载体两性电解质pH梯度等电聚焦是在支持介质
中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极 之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电 的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动， 并聚集于相当于其等电点的位置。
等电聚焦分离示意图
常规PAGE和等电聚焦电泳的区别
载体两性电解质和pH梯度的形成
定量测定：
凝胶电泳：装柱操作，铺板操作。 近来聚丙烯酰胺凝胶电泳法有了两个新 进展： A、不连续凝胶电泳。 B、十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙烯酰胺 凝胶电泳。
1、不连续凝胶电泳： 不连续凝胶由两层组成，上层为浓缩层 （丙烯酰胺2~3%），下层为分离层（丙 烯酰胺5~25%）。
蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和 分子形状的改变
未知蛋白质分子量的测定
基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可 以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的 分子量测定；
– 以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳
得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校
正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行
离子强度的选择
离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电
泳速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲 能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。 一般选择缓冲液的离子强度为0.01~0.1 mol/L之间
凝胶浓度的选择
由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度， 而且取决于分子的大小、形状。因此，与凝胶的分 子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速 度）密切相关。 根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将 凝胶分为： – 非排阻性凝胶（unrestrictive gel）:浓度0.7 ~1.0%的琼脂糖凝胶； – 排阻性凝胶（restrictive gel）：浓度大于1%的 琼脂糖凝胶和常规PAGE
于蛋白质的尺寸和形状。
PAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳
电泳前的准备工作
缓冲系统的选择：
– 保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物
活性的保持；
– 电泳时间和分辨率：从理论上讲PAGE可
以在任何pH进行，但实际上过酸或过碱的 条件下将发生某种水解（脱酰胺）。因此， pH应限制在3~10之间。
基本原理： SDS能以一定比例与蛋白质结合，并使 蛋白质带有大量的负电荷，（大大超过 原来所带电荷），从而使天然蛋白质分 子之间电荷差别下降乃至消除。同时蛋 白质的结构也在 SDS作用下变的松散 （蛋白质变成多肽），形状趋于一致， 排除了电泳过程中电荷的影响，使 SDS—聚丙烯酰胺电泳时，蛋白质迁移 率的差异仅是相对分子质量的函数。
缓冲系统的选择原则
是两种标准的对立权衡
– 如果缓冲液的pH选择在远离样品中各种蛋白的 等电点，蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳 时间短，区带细而窄； – 如果缓冲pH选择在靠近被分离样品的一种或几 种蛋白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷 密度差别大，分辨率就高；
因此，常常选择pH 8.0~9.5的缓冲，常用的缓冲 液有Tris-甘氨酸（pH 8.3~9.5），Tris-硼酸(pH 8.3~9.3)和Tris-醋酸（pH 7.2~8.5）
SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得 到相应的分子量；
LgM = A - KRm
M—相对分子量 A—常数 K—斜率 Rm—迁移率
由于蛋白质结合SDS的量与蛋白质种类、pH、 I、缓冲液组成有关。一般都必须用已知相对 分子量蛋白质作为指示蛋白质、与被测样品 在同一条件下进行电泳，给出LgM –Rm曲线， 求出样品Rm值对应的LgM ，计算出被测样品 相对分子量。
装置:
特点： 优点：消除分子扩散引起的分离度下降。 缺点： 1、载体两性电解质对产品产生污染； 2、pH梯度的稳定性不高； 3、操作过程中发生凝胶脱水起皱现象。
载体两性电解质pH梯度等电聚焦
等电聚焦（isoelectrofocusing）, IEF 利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同， 在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋 白质的分离和分析。 利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白 质和两性分子。 根据建立pH梯度的原理不同，梯度有分为载体两 性电解质梯度（Carrier ampholytes pH gradient） 和固相梯度。
（2）区带电泳：在支持物上电泳时蛋 白质混合物被成若干区带。 根据支持物物理性质的不同可分为4类： 滤纸电泳和薄膜电泳，粉末电泳，细丝 电泳，凝胶电泳。 多孔介质称为载体，应用最普通的是以 滤纸或凝胶为载体故称为纸电泳法或凝 胶电泳法。
第一节 凝胶电泳法
凝胶电泳的作用是基于凝胶过滤作用 （分子筛作用）和电泳淌度的双重机理， 所以它能获得较高的分辨率。 凝胶电泳：凝胶过滤作用（分子筛作用） 电泳淌度正比于 电荷数（电荷效应） 单位电场强度下的运动速度称为离子淌 度或迁移率。
蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液 中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与
其它大分子的相互作用。
带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子 尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生 物学与化学特性。