生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎

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细胞的破碎分析

植物细胞壁的结构

对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～ 3μm），富有弹性。初生壁由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。微纤丝是构成植物细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。
图1 革兰氏菌细胞壁结构图
（a）革兰氏阳性菌（b）革兰氏阴性菌
酵母的细胞壁结构
最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状；上面的是一层糖蛋白；最外层是甘露聚糖，由 1,6- 磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物。破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。
细胞壁的组成与结构
微生物壁厚/nm 层次主要组成革兰氏阳性细菌 20~80 单层肽聚糖（40 ％～90％）、多糖、胞壁酸、蛋白质、脂多糖（1 ％～4％）革兰氏阴性细菌 10~13 多层酵母菌 100~300 多层霉菌 100~250 多层
肽聚糖（5 葡聚糖（30 多聚糖（80 ％～10％）％～40％）％～90％）脂类、蛋白质脂蛋白、脂甘露聚糖多糖（11 （30％）、％～22％）蛋白质（6 磷脂、蛋白％～8％）、质脂类（8.5 ％～13.5）

本章的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
概述
不同类型细胞生产目标产物的类型：

动物细胞多分泌到细胞外培养液植物细胞多为胞内产物微生物（细菌/酵母/霉菌等）胞内、胞外
概述
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，
及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。

生化分离工程_苏海佳_第三章细胞破碎

5. 胞内产物的选择性释放
细胞完全破碎的缺点：所有胞内的蛋白质全部释放出来，粘度增加，杂质增加，给后面分离纯化带来困难。
1、目标：细胞不完全破碎，选择性释放，其他物质尽量少释放，粗分。
生化集成：利用两种以上的不同阶段的分离过程同时进行。
2、原因：例如利用珠磨法破碎酵母细胞时，各种酶的释放速度不同，靠近细胞膜和细胞壁的酶先释放，细胞内部或细胞器内后释放。
本章要点
珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波法破碎细胞的基本原理和应用条件？胞内产物的选择性释放的原理？
生活中的辛苦阻挠不了我对生活的热爱。21.1.1921.1.19Tuesday, January 19, 2021 人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。04:49:2704:49:2704:491/19/2021 4:49:27 AM 做一枚螺丝钉，那里需要那里上。21.1.1904:49:2704:49Jan-2119-J an-21 日复一日的努力只为成就美好的明天。04:49:2704:49:2704:49Tues day, January 19, 2021 安全放在第一位，防微杜渐。21.1.1921.1.1904:49:2704:49:27Januar y 19, 2021 加强自身建设，增强个人的休养。2021年1月 19日上午4时49分21.1.1921.1.19 精益求精，追求卓越，因为相信而伟大。2021年1月 19日星期二上午4时49分27秒04:49:2721.1.19 让自己更加强大，更加专业，这才能让自己更好。2021年1月上午 4时49分21.1.1904:49Januar y 19, 2021 这些年的努力就为了得到相应的回报。2021年1月19日星期二4时49分27秒04:49:2719 January 2021 科学，你是国力的灵魂；同时又是社会发展的标志。上午4时49分 27秒上午4时49分04:49:2721.1.19 每天都是美好的一天，新的一天开启。21.1.1921.1.1904:4904:49:2704:49:27Jan- 21 相信命运，让自己成长，慢慢的长大。2021年1月19日星期二4时49分27秒Tues day, January 19, 2021 爱情，亲情，友情，让人无法割舍。21.1.192021年1月19日星期二 4时49分27秒21.1.19

生物分离工程(三版)03章课件

淀方法的原理和影响因素应用：采用不同的试剂方法实现蛋白质
的沉淀
7
沉淀的定义
由于物理环境的变化而引起溶质溶解度的降低、生成固体凝聚物的现象，称为沉淀。
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沉淀与结晶的区别
沉淀生成的固体颗粒是不定形的结晶产品为单一组分，而沉淀凝聚物则
成分非常复杂（除了目标产物外，还夹杂着多种共存的杂质、盐和溶剂等）沉淀的纯度远低于结晶多步沉淀操作也可获得高纯度的目标产品
4
初级分离概念
初级分离是指从发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。
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初级分离特点
分离对象：体积大、杂质含量高；分离技术：低操作成本、适于大规模生产
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沉淀分离－学习要点
识记：盐析和盐溶概念理解：蛋白质凝集沉淀的屏障，各种沉
32
等电点沉淀-实现方式
在低离子强度下调整溶液pH值至等电点在等电点的pH值下利用透析等方法降低
溶液的离子强，使蛋白质沉淀
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等电点沉淀-操作特点
等电点沉淀在较低的离子强度下进行，因此沉淀操作结束后无需脱盐
与其它沉淀结合使用，例如在等电点附近进行的盐析沉淀操作时可以获得更小的蛋白质溶解度
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其他沉淀技术
聚合物沉淀
非离子型聚合物沉淀聚电解质沉淀
重金属盐沉淀蛋白质生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质
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沉淀生成动力学-沉淀生长
异向生长发生在沉淀生成初期，微细的蛋白质颗粒
为布朗粒子，沉淀生长为扩散速率控制同向凝聚
较大的沉淀颗粒在搅拌剪切作用下通过碰撞而进一步凝聚，生成大颗粒沉淀
高离子强度下的盐析

细胞破碎和生化分离技术-PPT

缺点: A、影响因素多,细胞种类、浓度和处理时间、探头材料和形状; B、有效能量得利用率低; C、产热大,需控温; D、不易放大,仅应用于实验室规模得细胞破碎。
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法得作用机理不尽相同,有各自得适用范围 (包括菌体细胞、细胞发酵液得特性)和处理规模(实验室或工业用)
碟片式离心机
• 就是在管式离心机得基础上发展起来得,在转鼓中加入了许多重迭得碟片,缩短了颗粒得沉降距离,提高了分离效率。
• 就是生物工业中应用最为广泛得一种离心机 • 有一个密封得转鼓,内装十至上百个锥顶角为60-100゜锥
形碟片。 • 碟片间得距离一般为0、5-2、5mm。
碟片式离心机工作原理
浓度。 • 微滤技术有着广泛应用和众多得优点。
微滤得操作模式
• 无流动操作模式和错流过滤操作模式
微滤设备
• 板框式膜过滤器 • 管式膜过滤器 • 中空纤维式膜分离器 • 螺旋卷式膜分离器
离心技术
• 一、离心分离得基本原理 • 二、离心机得类型 • 三、离心方法 • 四、离心条件得确定 • 五、影响离心效果得主要因素与控制
心机 • 据设备结构特点分:管式、蝶式、螺旋式……
离心机得种类与用途
按速度和离心力: 1、常速离心机最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g 以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离; 2、高速(冷冻)离心机 1×104～2、5×104rpm,相对离心力104～ 105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离; 3、超速离心机转速2、5～8×104rpm,相对离心力5×105g;用于 DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化;检测纯度;沉降系数和相对分子量测定等。

生化分离-03细胞的破碎和分离

3.3 细胞破碎技术
计算破碎遵循一级动力学定律, 即
对上述方程积分得
对于n次连续搅拌研磨操作，则得蛋白质的物料平衡式
θ：平均停留时间，V：磨腔的总体积，Q：发酵液的流量。
3.3 细胞破碎技术
影响因素
a) 转盘外缘速度(见下图)：适合条件：圆盘外缘速度 < 20 m/s, 一般在 5-15 m/s。
3.3 细胞破碎技术
不同流量和搅拌速度下的效率。g-20， -50， -100 10-6 m3/s 流量；1–8， 2–10， 3–15， 4–20 m/s 外缘速度
3.3 细胞破碎技术
2)、液体剪切法(最常用的方法之一、液体剪切法最常用的方法之一最常用的方法之一)
操作
3.3 细胞破碎技术
3.7 基因工程表达产物
变性液稀释(取1份变形液+99份上述buffer(不含DTT)，使尿素浓度小于0.1M，4°C下搅拌24h）复性液浓缩(用截留10000D的超滤器浓缩100倍)，透析后离心 (15000r/min离心30min) 浓缩上清液 Sephacryl s-200柱层析分离柱层析分离层析柱2×100cm，pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱收集主峰、冻干、终产物 (纯度可达100%，DNA及热源合格)
A、细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间，破碎程度均匀，避免反复和过度破碎； B、破碎的程度可无级调节，避免细胞内部结构的破坏，特别适合于细胞器的回收； C、实验室和工业规模均可应用，细胞浓度在10-20%，实验室规模的间歇处理能力在50-500 mL/h，工业规模的连续处理在 10,000 mL/h 以上。
3.5 破碎方法的选择
选择的一般原则

生物制药学——第三章生物材料的预处理、细胞破碎和液固分离PPT课件

2、加入絮凝剂
絮凝作用：胶体悬浮液中加入絮凝剂，胶粒吸附在絮凝剂表面上的功能团上，产生架桥
联接形成巨大的絮凝团沉淀出来的过程。
天然的或人工合成的有机高分子化合物。（如壳聚糖、海藻酸钠、明胶及酰胺类衍生物、
聚苯乙烯类衍生物和聚丙烯酸类等）

2、助滤剂：硅藻土、纸浆、石棉、纤维素、未活化的碳等
要求：惰性、无毒、细度及硬度，成本低。使用方法：预铺法、混合法、生成法。

二、离心分离
1、过滤式离心机

2、沉降式离心机管式离心机碟片式离心机螺旋卸料离心机

第三节液-固分离
一、过滤
（一）过滤方式
1、常规过滤 2、错流过滤

错流过滤装置

错流过滤原理示意图

错流过滤的优点 1）收率高 2）滤液质量好 3）连续工艺，自动化；不需助滤剂 4）完全封闭的系统，消除了污染的危险
第三章生物材料的预处理、细胞破碎和液固分离

主要内容
❖生物材料的预处理 ❖细胞破碎 ❖固-液分离

第一节生物材料的预处理
生物原料的特点
1、含量低 2、杂质多 3、易变性失活
（现代生物技术：微生物工程、细胞工程、基因工程、酶工程）
管式离心机

碟片式离心机

螺旋卸料离心机

三、影响液-固分离的因素
（一）悬浮物种类（二）悬浮液黏度（三）其他因素

写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
目的：去除两大类杂质 1、可溶性黏胶状物质 2、某些无机盐

（一）去除细胞碎片与杂蛋白
1、加入凝聚剂
凝聚作用(coagulation)是指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。 (P117页)

细胞破碎方法

细胞破碎（clasmatosis）的方法2010-02-20 21:00:42 来源：易生物实验浏览次数：615 网友评论0 条不同的细胞器分离的方法是不同的，因此随之而然的破碎细胞的方法也是有差异的。

关键词：细胞细胞破碎clasmatosis不同的细胞器分离的方法是不同的，因此随之而然的破碎细胞的方法也是有差异的。

具体如下：一、细胞器的分离：制备某种生物大分子时，往往需要采用细胞中某一部分为材料；或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，通常破碎细胞后，先分离各组分，以防干扰，这对制备—些高难度和高纯度的生物大分子是必要的，细胞器的分离，一般采用差速离心法，此法是利用细胞各组分质量大小不同，在离心管不同区域沉降的原理，分离出所需组分，分离得到的细胞器，其纯度可采用电子显微镜法、免疫学法或测定标志酶活力法进行鉴定。

二、细胞器的分离有时需要将组织细胞破碎，然后根据待分离的细胞器的理化特性，选择适当的分离方法。

一般采用差速离心或密度梯度离心的方法达到分离细胞器的目的。

三、破碎方法：(1)杆状玻璃匀浆器法：该匀浆器由一根端部表面磨砂的玻璃杆和一个内壁磨砂的玻璃套管组成。

使用时，先用锋利的刀片把组织块切碎，然后把碎块加入套管中，用力使玻杆移动使组织细胞破碎。

(2)高速组织捣碎机法：使用时将4℃预冷的组织碎块或细胞悬液加入捣碎机的梅花玻璃杯中，至杯体积的1/3即可盖好玻璃杯盖，固定好带杆叶片刀，缓慢调整旋转速度，一般开机数十秒后，组织细胞即可被高速旋转的叶片刀破碎。

但不宜时间过长，以防高速旋转产生热而导致分离物中的活性物降解，用冷却水降温更好。

(3)超声波处理法：超声波发生器能产生高强度的超声信号，经换能器传送至与之接触的溶液中，由声波形成冲击和振动而产生剪力，致使细胞破碎，动物组织肝、肾、胸腺、淋巴结、腹水细胞、红细胞、体外培养的细胞均可在短时间内破碎，因超声时可产热，应注意冰浴冷却，生物大分子如核酸和酶对超声敏感，一般不宜采用。

第三章细胞的分离与破碎

细胞破碎动力学方程：
影响反应速率常数K的因素：珠体直径：以细胞大小、浓度为选择依据；珠体的装量要适中；搅拌速度应适当：速度高，破碎率提高，能耗大；操作温度：温度高，易破碎，控制在5~40℃，使目的产物不受破坏；细胞浓度；料液性质
延长研磨时间、增加珠体量、提高搅拌转速和操作温度等都可有效地提高细胞破碎率。高破碎率将大大增加能耗；温度升高；大分子物质损失增加；细胞碎片较小，不易分离。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。
二、细胞破碎的方法
细胞破碎方法按是否使用外力分为机械法和非机械法。机械法有：珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法、 X-press法等。使用机械法时，机械能转为热量，温度升高，多数情况下采用冷却措施。非机械法有：酶溶法、化学法、物理法、干燥法等。
高压匀浆器和珠磨机在实验室和工业上得到应用；超声波法和非机械法处在实验室应用阶段。
（一）机械法 1、珠磨法（Bead mill）（固体剪切方法）工作原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子和细胞之间剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。珠磨机破碎是最有效的细胞物理破碎法。细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。
在工业上利用微生物生产的大多数化学物质是胞外型的，它们是在微生物细胞内合成，然后再分泌到周围环境中；此外还有不少产物是胞内型的；以大肠杆菌为宿主进行表达的蛋白质产品多为胞内产物。
第一节
细胞的分离
微生物或动植物细胞培养，产物无论在胞外或胞内，都需进行细胞与培养液的分离。常用的细胞分离方法（固液分离方法）包括过滤与离心沉降。
2、高压匀浆法 (High-pressure homogenization)（液体剪切方法）高压匀浆法是大规模细胞破碎的常用方法，所用的设备是高压匀浆器，由高压泵和匀浆阀组成。其工作原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环，使细胞破裂。

生物工程下游技术第三章微生物细胞破碎

超声波的细胞破碎效率与细胞种类、 ◆超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。波的声频、声能有关。 ◆该法在实验室小规模细胞破碎中常用。该法在实验室小规模细胞破碎中常用。在实验室小规模细胞破碎中常用 ◆超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。物质失活。一般杆菌比球菌易破碎杆菌比球菌易破碎，细菌比G+ G+细菌易 ◆一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。破碎，对酵母菌的效果较差。
–(a)α-和β-葡聚糖的混合物 (a)α(a)α –(b)糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来 (b)糖蛋白的网状结构， (b)糖蛋白的网状结构 –(c)主要是蛋白质 (c)主要是蛋白质 (c) –(d)主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。 (d)主要是几丁质几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。 (d)主要是几丁质，
1.珠磨法（ mill） 1.珠磨法（Bead mill）珠磨法
原理：原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm 1mm）石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走,但在大型设备中，套冷却的方式带走,但在大型设备中，采用夹套冷却带走热量是一个需要考虑的问题。却带走热量是一个需要考虑的问题。

2复件 3细胞的破碎与分离

2.细胞破碎方法的分类：
机械法
酶法化学法物理法后面将作详细介绍。
（1）机械法匀浆法研磨法细胞通过高的机械剪切力被破坏。热量的产生是该法的一个缺点。不容易规模放大: 如果一种方法可以在实验室规模下操作，我们并不知道这种方法在大规模生产中是否可行。所以，这部分内容主要作为实验的指导，而不是工程分析。
（3）表面活性剂法疏水基团将溶解的脂蛋白包在中心，亲水基团在外，膜的通透性改变而溶解。适用于与膜相结合的酶的溶解。
7.物理法
（1）渗透压冲击法细胞经高渗溶液使之脱水收缩，然后转入水或缓冲液，渗透压突然变化，细胞快速膨胀而破裂。为各种破碎方法中最温和的，适用于易破碎的细胞。如：溶血现象。
3.2 细胞破碎理论
1.细胞的破碎
压撞
剪切
渗透
冻胀
破壁破膜
（1）剪切力F 假定细胞直径为d(m)，维持球体所需的综合维持力为(N/m)，则破碎细胞所需F(Pa)为：
如利用流体剪切力(Pa)的作用，则在牛顿流体中：
则破碎细胞的速度梯度为：
du 4 dy d
意义：细胞直径，所需压力或剪切力，破碎难度。
3.7 细胞破碎的评价 1.破碎率定义：
N0：原始细胞数 N：破碎后残存的正常细胞 N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。
2.直接计数法（1）方法样本稀释 --染色 --- 上样 --- 计数
（2）优点：方法简单。（3）缺点： ①计数时间长 ②只有活细胞才被计数，误差大 ③细胞聚集时，不利计数 ④染色误差。
不少情况下，产物不在发酵液中，而是包裹在生物体内，属胞内产物。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素也是包含在生物体中。不少情况下，产物还是包裹在生物体内，属胞内产物。

生物分离工程第二、三章综合测试

1第二章过滤和离心第三章细胞破碎一、名词解释、1.凝聚:就是向胶体悬浮液中加入某种电解质，使胶粒的双层电位降低，排斥作用降低，使胶体体系不稳定，胶粒间因相互碰撞而产生凝聚的现象。

2.絮凝：当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生架桥联接，形成较大凝絮团的过程。

3.助滤剂：是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，滤速增大。

4.分离因数：是指离心设备所能达到的离心力与重力加速度的比值，用Z表示。

Z=4π2N2r/g5.盐溶：在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。

这种现象称为盐溶。

6.盐析：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象称为盐析。

7.包含体：外源基因表达的产物不能分泌到细胞外，而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒。

8.高压匀浆法：也称高压剪切破碎法，是利用高压匀浆器破碎细胞的一种方法。

即细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。

9.珠磨法：是指在搅拌机的高速搅拌下微珠高速运动，微珠与微珠之间以及微珠和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。

10.酶溶法：酶溶法利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大细胞内产物的通透性。

11.超声破碎法：超声波破碎发是利用发射15~24kHZ的超声波探头处理细胞悬浮液。

是在超声波作用下发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。

12.空化现象：在相当高频率的超声波作用下，液体产生空穴泡，这种空穴泡在超声波继续作用下膨大和破碎，从而产生极强的剪切力，使细胞破碎。

13.有机溶剂沉淀：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶液，水的活性降低，随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电集团或亲水集团的水化程度降低，蛋白质分子间的静电引力增大，从而凝聚和沉淀。

生物分离工程细胞分离与破碎

vg
2 S L dp
18 L
g
v S S 2 r
细胞分离－离心分离方法

差速离心分级
区带离心
差速区带离心
平衡区带离心
差速离心分离
差速离心是以菌体细胞的收集或除去为目的
的固液离心分离方法，应用某一特定颗粒沉淀
的离心力在预定的离心时间内得到一部分颗粒
沉淀及包含未沉淀颗粒的上清液。
－细胞膜组成
（A）
（B）
胞内产物释放
－影响产物释放的环境因素
在复杂培养基中生长的大肠杆菌细胞其破碎较单一培养基中生长的大肠杆菌细胞更难；对数生长期的细胞会表现得更加脆弱。从连续培养过程中获得的、具有较高比生长速率的念珠菌的细胞壁更加脆弱，而摇瓶培养的念珠菌体则有更加充裕的机会构建更加坚固的细胞壁。酵母细胞壁的厚度和破碎阻力随年龄增长而增加经常在幼酵母细胞中出现的芽痕（Bud scars）可引起酵母细胞局部细胞壁强度的降低

模型校正

形态校正：颗粒的形状系数速度校正：空隙率函数
S
F ( )
A AP

提高重力沉降的途径

加入中性盐：双电层排斥电位降低加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝图引入外力
细胞分离－重力沉降理论

模型校正
形态校正速度校正

提高重力沉降的途径
加入中性盐；加入高分子絮凝剂引入外力
模型假设：
细胞破碎速度与未破碎细胞浓度x成正比从破碎的细胞释放产物的速率与胞内未释放的产物浓度成正比模型推导
胞内产物释放
－非机械破碎之
酸碱处理化学试剂处理酶溶自溶渗透压冲击法冻结-融化法

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•可采用间歇式与连续操作。 •两种情况下，细胞破碎动力学可近似表示为：
•间歇操作：t为破碎操作时间
• 破碎阻力：肽聚糖的网状结构
•网结构的致密程度和强度，与肽键的数量和交联度有关。
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•Gram-negative procaryotes
•革兰氏阴性原核生物（E.coli）
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•2、酵母的细胞壁
•组成：由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎。 •例如，面包酵母的细胞壁厚约70nm。 •特点：
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
3·1 细胞壁结构和化学组成
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•1. 细菌的细胞壁 • 所有的细菌细胞壁由坚固的骨架——肽聚糖组成
•1、肽聚糖由聚糖链借短肽交联而成，网状结构，使细胞有一定的形状和强度； •2、短肽一般由4-5个氨基酸组成，常含有D-氨基酸与二氨基庚二酸； •3、聚糖链由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替通过（1-4）糖苷健连接而成。短肽接在N-胞壁酸上，相邻的短肽交叉相连，形成网状。
•机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波等方法。
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•1. 高压匀浆法（high-pressure homogenization） •原理：利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放。
•细胞的大小，形状、聚合物的交联程度
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•※ 3.2 细胞破碎和产物释放原理
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•机械法 •化学法
•压缩力和剪切力——高压匀浆、珠磨、撞击破碎、超声波破碎
•利用化学、生化试剂或酶改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率，或完全溶解细胞壁，形成原生质体，在渗透压作用下，细胞膜破裂释放胞内物质。
•4、需设置冷却装置。
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•2. 珠磨法（Bead milling） •原理：细胞悬浮液与玻璃珠（或石英砂，或氧化铝）一起高速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎，
•作用力：剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•WSK卧式高效全能珠磨机 •ZM系列生化卧分离式工程密苏海闭佳第珠三章(细砂胞破)碎磨机
•纤维素是由链状结构的-D-葡萄糖以1，4-葡萄糖苷键结合，纤维素分子束聚集——微纤丝 ——植物细胞壁的框架，而其他物质填充在微纤丝之间的空隙中——植物细胞壁的基本结构。
•在干燥植物体中纤维素约占总重的1/3一1/2。
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•破碎细胞的目的 •就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏 (增大通透性)或破碎，释放其中的目标产物。 •影响破碎的因素：
•主要有：酸碱处理、化学试剂处理、酶溶
•物理渗透法
•渗透压冲击法和冻结—融化法
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•细胞破碎机理
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•※ 3.3 mechanical d胞破碎
•机械法破碎特点
•1、处理量大，破碎快，时间短，效率较高，工业规模的重要手段； •2、作用力：挤压，剪切和撞击作用； •3、在许多情况下，细胞内含物全部释放出来； •4、由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施。
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•特点：
所有细菌都含有肽聚糖的网状结构。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，约15-50nm，肽聚糖含量占40%一90%。其余是多糖和磷壁酸；革兰氏阴性菌的肽聚糖层约1.5-2.0nm，外有一外壁层约8-l0nm，由脂蛋白和脂多糖及磷脂构成的两层外壁层。革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌坚固，较难破碎。
•1、里层葡聚糖的细纤维——细胞壁的刚性骨架； •2、覆盖在细纤维上的是一层糖蛋白； •3、外层是由1，6—磷酸二脂键共价连接而成的网状结构的甘露聚糖； •4、其内部有甘露聚糖—酶的复合物。
•破壁阻力：壁结构交联的紧密程度和壁厚。
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•植物细胞壁的主要组成成分是纤维素 •在初生壁上还有半纤维素和果胶质
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•高速匀浆破碎的动力学方程为：
•细胞破碎率S与操作压力P和循环次数N之间的关系。 •k为破碎速度常数 •上述参数随微生物种类和培养条件的不同而有所差异
•压力P可用动能表达：
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•细胞破碎率用包内产物释放率表示：
•影响因素： •1、压力、温度和通过匀浆器阀的次数，操作压力影响最大。工业生产中常采用的压力为55－70Mpa 。 •2、不同菌种，不同生长期以及不同培养条件。
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
2020/11/26
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•胞外
•微生物的代谢产物
多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。
•胞内
有些目标产物存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积。脂类和一些抗生素也是包含在生物体中。
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•优点： •1、操作参数少，且易于确定； •2、样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好 •3、适用于酵母和大多数细胞的破碎。
•适用范围：
•1、适用于酵母和大多数细菌细胞；
•2、细胞浓度可达20%；
•3、团状或丝状真菌易造成堵塞，一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用；
•细胞
目标产物就是细胞本身，如面包酵母。
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
生化分离工程苏海佳第三章细胞破碎
•胞外物质 •胞内物质
•发酵液预处理——澄清液
•收集菌体——细胞破碎— —转入液相——碎片分离
•细胞破碎是指：选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。
•主要划分为两大类: 化学法和机械法