生物工艺学下游技术第三章细胞破碎
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真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关
它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所 以强度有所提高。
几丁质就是由 N- 乙酰葡萄糖胺分子，以 b -1,4 葡萄糖苷键连接而成的多聚糖。
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一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成 了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状
覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白， 再外面是由1，6－磷酸二酯键共价连接而成网状结
构的甘露聚糖。有甘露聚糖－酶的复合物，它可以 共价连接到网状结构上，也可以不连接。
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真菌的细胞壁
大多数真菌的多糖壁，主要存在三种聚合物， 葡聚糖（主要以β－（1→3）键连接，某些 以β－（l→6）键连接），几丁质（以微纤 维状态存在）,糖蛋白。
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二、常用破碎方法
分
类
机 珠磨法 械 法 高压匀浆法
超声破碎法
X-press法
非 酶溶法 机 械 化学渗透法 法
渗透压法
冻结融化法
干燥法
作用机理
适应性
固体剪切作用
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分 子目的产物易失活，浆液分离困难
液体剪切作用
可达较高破碎率，可大规模操作，不适合 丝状菌和革兰氏阳性菌
反复冻结-融化 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物
改变细胞膜渗透性 编辑条pp件t 变化剧烈，易引起大分子物质失活14
1.珠磨法（Bead mill）
原理：
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化 铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨 剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放 出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内， 浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹 套冷却的方式带走。
每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环
上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动
微生物 革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 酵母菌
霉菌
壁厚/nm
20-80
10-13
100-300
100-250
层次
单层
多层
多层
多层
主要组成 肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%）
肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质
葡聚糖
多聚糖
（30-40%） （80-90%）
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离， 溶酶价格高，通用性差
改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较 低，通用性差
渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方法结合使用
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15
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德 国西门子机械公司制造）。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大 分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片 不易分离而给后续操作带来的困难。
对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎， 使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的 分离。
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细胞壁的组成和结构
细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含 物释放出来。微生物的细胞外围通常包括细 胞壁和细胞膜。
细胞膜使细胞内外保持一定的浓度差，它 主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易 受渗透压冲击而破碎。细胞破碎的主要阻力 来自于细胞壁。
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2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）
——大规模细胞破碎的常用方法
采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲
击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，
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3
细菌的细胞壁
几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的骨架——肽 聚糖组成，是由肽聚糖链借短肽交联而成，使细胞 具有一定的形状和强度。
短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L－丙氮酸－ D－谷氨酸－L－赖氨酸－D－丙氨酸。
肽聚糖键是N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸交 替地通过β－（l→4）糖苷键联接而成。短肽接在 N－乙酰胞壁酸上，相邻的短肽又交叉相联，形成 了网状结构。
甘露聚糖 脂类
（30%） 蛋白质
蛋白质
（6-8%）
脂类
（8.5-
13.5%）
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细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结 构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不 及革兰氏阳性细菌的坚固；
酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密 程度和它的厚度；
由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构， 其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构， 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在 的肤键的数量和其交联的程度，如果交联程度大， 则网结构就致密。
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革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌
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酵母菌的细胞壁
主要成分为葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比革 兰氏阳性菌稍厚，而且其厚度随菌龄增加而增加。
微生物细胞的破碎
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1
微生物细胞的破碎
微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，称 为胞外产物。(例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌 产生的糖化酶等)
还有许多是存在于细胞内(例如青霉素酰化酶，碱 性磷酸酯酶等)称为胞内产物。
对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获 得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，
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革兰氏阳性菌的细胞壁
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5
革兰氏阳性菌的细胞壁
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6
细菌的细胞壁
革兰氏阳性菌的细胞壁Leabharlann Baidu厚（15－50 nm），肽 聚糖占40％一90％，其余是多糖和磷壁酸，
革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄（1.5－2.0nm）， 最外面还有一较厚的外壁层（8—10 nm），外壁 层主要由脂蛋白，脂多糖组成。
它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所 以强度有所提高。
几丁质就是由 N- 乙酰葡萄糖胺分子，以 b -1,4 葡萄糖苷键连接而成的多聚糖。
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一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成 了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状
覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白， 再外面是由1，6－磷酸二酯键共价连接而成网状结
构的甘露聚糖。有甘露聚糖－酶的复合物，它可以 共价连接到网状结构上，也可以不连接。
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真菌的细胞壁
大多数真菌的多糖壁，主要存在三种聚合物， 葡聚糖（主要以β－（1→3）键连接，某些 以β－（l→6）键连接），几丁质（以微纤 维状态存在）,糖蛋白。
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二、常用破碎方法
分
类
机 珠磨法 械 法 高压匀浆法
超声破碎法
X-press法
非 酶溶法 机 械 化学渗透法 法
渗透压法
冻结融化法
干燥法
作用机理
适应性
固体剪切作用
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分 子目的产物易失活，浆液分离困难
液体剪切作用
可达较高破碎率，可大规模操作，不适合 丝状菌和革兰氏阳性菌
反复冻结-融化 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物
改变细胞膜渗透性 编辑条pp件t 变化剧烈，易引起大分子物质失活14
1.珠磨法（Bead mill）
原理：
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化 铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨 剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放 出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内， 浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹 套冷却的方式带走。
每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环
上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动
微生物 革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 酵母菌
霉菌
壁厚/nm
20-80
10-13
100-300
100-250
层次
单层
多层
多层
多层
主要组成 肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%）
肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质
葡聚糖
多聚糖
（30-40%） （80-90%）
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
固体剪切作用
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
酶分解作用
具有高度专一性，条件温和，浆液易分离， 溶酶价格高，通用性差
改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较 低，通用性差
渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方法结合使用
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实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德 国西门子机械公司制造）。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大 分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片 不易分离而给后续操作带来的困难。
对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎， 使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的 分离。
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细胞壁的组成和结构
细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含 物释放出来。微生物的细胞外围通常包括细 胞壁和细胞膜。
细胞膜使细胞内外保持一定的浓度差，它 主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易 受渗透压冲击而破碎。细胞破碎的主要阻力 来自于细胞壁。
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2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）
——大规模细胞破碎的常用方法
采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲
击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，
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细菌的细胞壁
几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的骨架——肽 聚糖组成，是由肽聚糖链借短肽交联而成，使细胞 具有一定的形状和强度。
短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L－丙氮酸－ D－谷氨酸－L－赖氨酸－D－丙氨酸。
肽聚糖键是N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸交 替地通过β－（l→4）糖苷键联接而成。短肽接在 N－乙酰胞壁酸上，相邻的短肽又交叉相联，形成 了网状结构。
甘露聚糖 脂类
（30%） 蛋白质
蛋白质
（6-8%）
脂类
（8.5-
13.5%）
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细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结 构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不 及革兰氏阳性细菌的坚固；
酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密 程度和它的厚度；
由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构， 其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构， 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在 的肤键的数量和其交联的程度，如果交联程度大， 则网结构就致密。
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革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌
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酵母菌的细胞壁
主要成分为葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比革 兰氏阳性菌稍厚，而且其厚度随菌龄增加而增加。
微生物细胞的破碎
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微生物细胞的破碎
微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，称 为胞外产物。(例如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌 产生的糖化酶等)
还有许多是存在于细胞内(例如青霉素酰化酶，碱 性磷酸酯酶等)称为胞内产物。
对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获 得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，
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革兰氏阳性菌的细胞壁
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革兰氏阳性菌的细胞壁
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细菌的细胞壁
革兰氏阳性菌的细胞壁Leabharlann Baidu厚（15－50 nm），肽 聚糖占40％一90％，其余是多糖和磷壁酸，
革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄（1.5－2.0nm）， 最外面还有一较厚的外壁层（8—10 nm），外壁 层主要由脂蛋白，脂多糖组成。