氨基酸总量测定

氨基酸总量测定

蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的蛋白质成分，如水解后的产物经月示、陈、肽等最后变成为氨基酸，氨基酸是构成蛋白质最基本的物质。

水解后的蛋白质和水解前的蛋白质在物理特性、化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以评价食品的营养价值。

氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普便使用），很多氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量。它们不能以氨基酸的百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氨（氨基酸态氮）的百分率来表示。当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从氮量计算出氨基酸的含量。

在评价蛋白质的营养价值时，除了测定蛋白质的含量，氨基酸氮量，还需要对各种氨基酸进行分离、鉴定，尤其对8种人体必需氨基酸进行定性定量分析。

1.1单指示剂甲醛滴定法

原理氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有一CooH基显示酸性，又含有一NH2基显示碱性。由于这两个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，一NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就用碱来滴定一COOH基，以间接方法测定氨基酸的量。反应式以下而三种形式存在:

试剂40%中性甲醛溶液，以麝香草酚醐为指示剂，以mo1/1NaOH 溶液中和0.1%麝香草酚酸乙醇溶液；0.100mo1∕1氢氧化钠标准溶液。

操作步骤

称取一定量样品（约含20毫克左右的氨基酸）于烧杯中（如为固体加水50毫升）,加2〜3滴指示剂，用O.1OOmo1/1NaOH液滴定至淡蓝色。加入中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。再用0.10OmC）I/1NaOH溶液滴定至淡蓝色，记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算氨基酸氮的含量。

计算

氨基酸态氮（％）=MVX0.014><100/W

式中：M一氢氧化钠标准溶液摩尔浓度

V一氢氧化内标准溶液消耗的总量（毫升）

W一样品溶液相当样品重量（克）

0.014一氮的毫摩尔质量g/mmo1

1.2双指示剂甲醛滴定法

原理与单色法相同，只是在此法中使用两种指示剂。从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法（此法操作复杂，但准确，不作介绍）相近。单色滴定法稍偏低，主要因为单指剂甲醛滴定法以氨基酸PH值作为麝香酚醐的终点，PH值在9.3。而双指示剂法是以

氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH值为7.0。从理论计算看，双色滴定法较为准确。

试齐IJ

三种试剂同单指示剂法

0.1%中性红（50%乙醇溶液）

操作步骤

取相同的两份样品，分别注入100毫升三角瓶当中，一份加入中性红指示剂2~3滴，用O.1OOmo1/1NaOH溶液滴定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加麝香草酚献3滴和中性甲醛20毫升，摇匀，以0.10OmOI/1NaOH标准溶液滴定至淡蓝色。按下述公式计算计算

氨基态氮(％)=M(V2-V])X0.014∕WXIOO

式中：V2一用麝香草酚献为指示剂时消耗标准碱液量(毫升) V1一用中性红作指示剂时碱液的消耗量(毫升)

M一标准碱摩尔浓度

W一样品的重量(克)

0.014—氮的量毫摩尔质量(g∕mmo1)

注意事项

单色指示剂甲醛滴定法，用碱完全中和一COOH基时PH为8.5〜9.5。

测定时样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定。

1.3年三酮比色法

原理

氨基酸在一定PH范围内，能与玮三酮生成蓝紫色化合物,可以比色定量。

反应式如下:

这种反应不是特异反应，主要根据氨基酸的性质而定。根据目前的报道，认为在一些事例中，都能观察到形成紫色的双一1,3一二酮荀。

试齐U

磷酸缓冲液(pH8.04):制备方法如下：

先配M/15磷酸二氢钾液：取磷酸二氢钾4.5350克溶于水中，定容至500毫升。

M/15磷酸氢二钠液：称取Na2HPO4∙12H2O119380克,溶于水中，定容至500毫升。取M/15磷酸二氢钾10毫升与M/15磷酸氢二钠190毫升混合即为pH8.04的磷酸缓冲液。

2%荀三酮液：称取荀三酮1克，溶于35m1热水中，加入40毫克氯化亚锡（Sne12∙H2O）,搅拌过滤（作防腐剂）。置冷暗处过夜，定容至50毫升。

氨基酸标准液：称取试剂纯干燥氨基酸（如异亮氨酸）0∙2000克，先用少许水溶解并定容至100毫升，摇匀。从容量瓶中取出10毫升于100毫升容量瓶中，加水至刻度。每毫升含氨基酸为200微克/毫升。

操作步骤

标准曲线制备：精确吸取氨基酸标准液（200微克/毫升）0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0毫升（相当于0,100,200,300,400,500,600……微克氨基酸），分别注入几个25毫

升容量瓶中，加水补足为4毫升，再加入玮三酮和磷酸盐缓冲液各1毫升，混合均匀。于水浴上加热15分钟，取出迅速冷至室温，加水至刻度，摇匀。静置15分钟，在570纳米波长下测定消光值并绘制标准曲线。

样品的处理同单指示剂法，取澄清的样品溶液2~4毫升,以下同标准曲线操作。以水代替样液同时作一空白，在570纳米波长下，测定消光值。从标准曲线上查得氨基酸微克量,按下列公式计算出样品中氨基酸含量：

氨基酸总量（毫克％）=C∕（WX1OOO）X1OO

式中：c一从标准曲线上查得氨基酸数量（微克）

w一测定的样品溶液相当于样品的重量（克）

IOoO一把微克换算成毫克

注意事项

苛三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈显淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下：

取10克荀三酮溶于40毫升热水中，加入1O克活性炭，摇动1