PCR常见问题及解决方案
PCR常见问题、原因分析及其对策
镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有 重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降； 镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失 败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐 ，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增 效果，因此需要确保模板的纯度和浓 度，避免使用降解严重的模板，以提 高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时， 合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特 异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视， 提高模板质量可以提高pcr的产量和特 异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质， 这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模 板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤 的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。
PCR常见问题及解决方案
PCR常见问题问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
PCR问题总汇及详细解决方案
PCR问题总汇及详细解决方案
PCR的影响因素很多的，尤其试剂的保存，人为的因素都很重要: 看看试剂是否有过期或保存不当，可能出现部分变质所以P不出来，换新的试剂看看
人为也很重要，冰上操作的时间，步骤等对P的效果很有影响，可找实验经验好点的人再试一试.
如果是怀疑仪器方面的问题，我觉得也有可能，可以去别的试验室借PCR仪看看是否能行.
别用自己的胶检测，用别人的胶检测试试，以前我P的很好，但是胶有问题老是扩散，后来用别人的胶试了试，非常赞.
本文针对PCR产物序列中引入了错误怎么办？PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带？如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带？对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
PCR体系是10ul的，每次PCR完了以后，管壁上有一层水气，需不需要覆盖矿务油？加多少，具体步骤应怎样？
PCR加样孔上有很亮的条带，但没有产物条带？
PCR的产量有许多因素决定他们的主次关系是什么,各因素又是怎么调节的？
PCR产物大约有900bP，哪种测序方法比较好？直接用纯化的PCR产物测序还是克隆到T载体上再测序？纯化PCR产物的方法哪种比较好？
引物间形成了比较多的二聚体，使产物很少。
这种情况该怎么处理?
为什么会产生弥散（smear）条带？如何解决？。
PCR常见问题及解决方案精品课件
适用范围
• 大规模基因检测 • 目的基因拷贝数极低的样本 • GC含量高,有二级结构的模板 • 复杂基因组样本 • 可直接检测菌落，基因点突变检测,
或者阳性克隆的筛选。
PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略
PCR常见问题
• 无扩增产物 • 非特异性扩增 • 拖尾 • 假阳性
特点
产品
性能
高扩增效率 •天为时代：Taq Plus
• TaKaRa：Ex TaqTM
复杂模板扩增
高保真
•天为时代： Taq Platinum
• Invitrogen：Pfx Platinum Taq High Fidelity
保真度低于Pfu聚合酶 但扩增效率较高
长片段扩增
Байду номын сангаас
•天为时代：Long Taq
ddH2O
•pH值适当 •避免污染
PCR标准反应体系
• DNA模板 • 引物 • 反应缓冲液 • Mg 2＋ • dNTP • ddH2O
• 耐热聚合酶
如何选择最合适的DNA聚合酶
• DNA 聚合酶的特性 • PCR 实验的不同需求
如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ DNA 聚合酶的特性
纯度 稳定性
PCR常见问题之一
• 无扩增产物
➢现象：正对照有条带，而样品则无；
原
因
1. 模板:含有抑制物，含量低
2. Buffer对样品不合适
3. 引物设计不当或者发生降
解
对
4. 反应条件：退火温度太高，延 策
伸时间太短
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA或加大模板的用量
2. 更换Buffer或调整浓度 3. 重新设计引物（避免链间二聚
PCR常见问题分析及对策
.PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低.6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
PCR检测常见问题与解决途径
P C R检测常见问题与解决途径------------------------------------------作者xxxx------------------------------------------日期xxxxPCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
PCR常见问题分析及解决策略
荧光定量PCR常见问题
溶解曲线不止一个主峰：
引物设计不佳：设计特异性引物； 引物浓度不适：降低引物浓度； 退火温度低：调整退火温度；
镁离子浓度过高：降低镁离子浓度；
模板中有基因组污染：注意提取过程； 耗材仪器不匹配； 反应体系污染等：设置阳性阴性对照。
荧光定量PCR常见问题
扩增效率低：
提高PCR特异性最重要的方法之一。
策略之四使用PCR增强剂
甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等 都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而 有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸 通过二级结构区。 增强剂浓度要适当。
荧光定量PCR常见问题
荧光定量PCR扩增效率确认： 相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率：-3~-3.5 PCR扩增效率（E）：0.9~1.2 重复性好：STD ＜0.2 特异性好
PCR常见问题、 原因分析及其对策
PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略 定量PCR常见问题 临床PCR检测的常见问题
PCR标准反应体系
• DNA模板
• 引物
• 反应缓冲液 • Mg 2＋浓度 • dNTPs • dH2O • 耐热聚合酶
反应体系对PCR扩增的影响
PCR常见问题之四-----假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原 因
靶序列或扩增产物的交叉污染
对 策
• • 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材 均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应 一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
现象：正对照有条带，而样品则无
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案!
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案！PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日进行检查，大于48h后带型不规章甚至消逝。
但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的推断，详细归类为以下常见的4点，描述如下：问题一：无扩增产物现象：正对比有条带，而样品则无。
缘由：1、模板:含有抑制物，含量低。
2、Buffer对样品不合适。
3、引物设计不当或者发生降解。
4、反应条件：退火温度太高，延长时间太短。
对策：1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量。
2、更换Buffer或调整浓度。
3、重新设计引物（避开链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物。
4、降低退火温度、延长延长时间。
问题二：非特异性扩增现象：条带与估计的大小不全都或者非特异性扩增带。
缘由：1、引物特异性差。
2、模板或引物浓度过高。
3、酶量过多。
4、Mg2+浓度偏高。
5、退火温度偏低。
6、循环次数过多。
对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR。
2、适当降低模板或引物浓度。
3、适当削减酶量。
4、降低镁离子浓度。
5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法。
6、削减循环次数。
问题三：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
缘由：1、模板不纯。
2、Buffer不合适。
3、退火温度偏低。
4、酶量过多。
5、dNTP、Mg 2+浓度偏高。
6、循环次数过多。
对策：1、纯化模板。
2、更换Buffer。
3、适当提高退火温度。
4、适量用酶。
5、适当降低dNTP和镁离子的浓度。
6、削减循环次数。
问题四：假阳性现象：空白对比消失目的扩增产物。
缘由：靶序列或扩增产物的交叉污染。
对策：1、操作时应当心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
2、除酶及不能耐高温的物质外，全部试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
PCR常见问题及解决方法
PCR常见问题及解决方法PCR常见问题及解决方法1)、不出现扩增条带a)、引物设计有误：核对引物设计方案。
b)、扩增体系配制错误：重复实验。
c)、扩增反应条件不优化：调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序。
d)、模板质粒质量偏差：长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板。
e)、模板的GC含量：GC含量过高会导致DNA的双链无法完全打开，此时加入Vazyme（诺唯赞生物）的PCR Enhancer(货号P021)可以有效降低解链温度；GC 含量过低会导致扩增效率较差，可适当延长引物长度或通过TD PCR摸索合适的反应条件。
2)、出现非特异性扩增带a)、引物设计不够优化：引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。
b)、模板不纯：模板被污染，需重新制备模板。
c)、试验条件不够优化：如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度、降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数；另外，可降低Mg2+及酶的浓度。
3)、条带弥散或拖尾a)、模板降解或过量：可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板，对于简单模板(例如质粒、λDNA)，每50ul反应使用1pg-10ng DNA；对于复杂模板(例如基因组、cDNA)，每50ul反应使用1ng-1ug DNA。
b)、酶量加太多：如Vazyme（诺唯赞生物）的高保真系列：50ul反应体系加1U，Taq系列：50ul体系加2U。
4)、条带很暗a)、增加模板量，提高循环数。
b)、多扩几管，胶回收浓缩。
5)、产物有错配a)、检查原始模板是否原本就是突变或错配的。
b)、少量序列存在非严谨序列，有相似重组序列，导致重组错位。
PCR实验中常见问题解决方法
QuikStrip 已变干。
加入 40 μL 水，在装载前轻轻上下移液以混合均匀。
3.电泳凝胶上看不到条带、对照 DNA 和PCR 产物
凝胶未正确制备。
确保正确稀释电泳缓冲液。
融化琼脂糖时需要特别注意较高浓度 (>0.8%) 的凝胶。在倒入凝胶之前，确保溶液 没有“团块 ”和玻璃状颗粒，也可以直接使用配置好的预制胶。省时省力。
凝胶未正确染色。
染色时注意浓度，实在不行就重新染色。
电泳装置或电源出现故障。
请联系电泳仪或电泳设备供应商，帮忙排除故障
4.凝胶染色后，DNA 条带模糊。
凝胶没有染色足够长的时间。
严格按照染色流程说明进行实验操作。
5.染色后，条带可见，但不存在 PCR 产物。
PCR扩增不成功。
注意引物设计是否合理，DNA聚合酶的加入量是否适宜。
PCR实验中常见问题解决方法
PCR实验中常见问题及解决方案
PCR实验中常见问题汇总
问题，管中的液体较少。
样品挥发，损失
确保加热的盖子达到适当的温度。
吸取样本后，尽快盖上PCR 管的盖子。防止挥发。
移液不准确
确保吸取 20 µL 引物混合物和 5 µl Lambda DNA 模板到 PCR 管中。样本量少时需要采用高精度移液器。
确保PCR的正确操作，温度设计是否合理。
6.染色后，凝胶上可见条带和对照 PCR 产物，其中一部分样品不存在。
PCR 反应中添加了错误体积的 DNA 和引物。
熟练使用移液器进行精准移液定量，确保移液的准确度
pcr技术审核中存在的问题和解决措施方案
反应条件不一致
总结词
反应条件不一致是PCR实验中常见的 问题之一，可能影响实验的重复性和 准确性。
详细描述
反应条件不一致包括但不限于：反应 体系不均一、反应温度不合适、循环 参数不一致等。这些问题会导致PCR 反应不均一，或者产生非特异性扩增 ，从而影响实验结果。
实验操作不规范解
02
决措施
规范实验操作流程
纯化模板
采用合适的纯化方法，如亲和色谱、离子交 换等，对模板进行纯化，以提高其质量和浓 度，减少非特异性扩增等问题的发生。
反应条件不一致解
05
决措施
建立反应条件标准化流程
确保PCR反应体系的一致性
确保每个PCR反应中使用的模板DNA、引物、酶等关键组件的浓度和质量相同，以确保 反应条件的一致性。
些标准。
对标准化操作规范的执行情况进 行监督和检查，以确保其实施效
果。
引物设计不合理解
03
决措施
建立引物设计标准流程
确保引物设计的科学性和合理性，建 立标准流程，包括引物设计的基本原 则、软件选择、参数设置、实验验证 等环节，确保每个步骤都得到规范执 行。
VS
针对不同实验需求，制定个性化的引 物设计方案，以适应不同的样本类型 、检测目标等实际情况。
制定标准的PCR实验操作流程 ，包括实验前的准备、实验操 作步骤和实验后处理等。
对实验操作流程进行详细说明 ，包括实验操作的细节和注意 事项，以确保实验结果的准确 性和可靠性。
对实验操作流程进行监督和检 查，确保实验操作严格按照规 定执行。
加强实验操作培训
01
对实验人员进行PCR技术的全面培训，包括理论知识和实践操 作，确保实验人员具备必要的技能和知识。
PCR 常见问题及解决方案
PCR 常见问题及解决方案1没有扩展条带可能的原因及对应的解决方案如下：酶失活或在反应体系中未加入酶。
Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
模板含有杂质。
特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA 脱嘌呤而影响PCR 的结果。
变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq 酶以前，将反应体系95℃加热5~10 分钟。
引物变质失效。
人工合成的引物是否正确。
是否纯化，或因储存条件不当而失活。
引物错误。
利用BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA 凝胶和PCR 程序的问题。
2PCR 产物量过少可能的原因和对应的解决方案如下：退火温度不合适。
以 2 度为梯度设计梯度PCR 反应优化退火温度。
DNA 模板量太少。
增加DNA 模板量。
PCR 循环数不足。
增加反应循环数。
引物量不足。
增加体系中引物含量。
延伸时间太短。
以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。
变性时间过长。
变性时间过长会导致DNA 聚合酶失活。
DNA 模板中存在抑制剂。
确保DNA 模板干净3扩增产物跑电泳条带弥散可能的原因和对应的解决方案如下：酶量过高。
减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
dNTP 浓度过高。
减少dNTP 的浓度。
MgCl₂浓度过高。
可适当降低其用量。
模板量过多。
质粒DNA 的用量应<50 ng，而基因组DNA 则应<200 ng。
引物浓度不够优化。
对引物进行梯度稀释重复PCR 反应。
循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR 循环。
退火温度过低。
电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。
若为PCR 试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
PCR常见问题分析及对策
PCR 常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 2009-03-28 11:38问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear 状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR 引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30 碱基之间。
PCR常见问题及解决方案
一、普通PCR常见问题及解决对策PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失。
1. 假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
1.1 模板①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
1.2 酶失活需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
1.3 引物引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
1.4 Mg2+浓度Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
1.5 反应体积的改变通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
PCR常见问题及解决方法
PCR常见问题及解决方法1)、不出现扩增条带a)、引物设计有误：核对引物设计方案。
b)、扩增体系配制错误：重复实验。
c)、扩增反应条件不优化：调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序。
d)、模板质粒质量偏差：长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板。
e)、模板的GC含量：GC含量过高会导致DNA的双链无法完全打开，此时加入Vazyme（诺唯赞生物）的PCR Enhancer(货号P021)可以有效降低解链温度；GC 含量过低会导致扩增效率较差，可适当延长引物长度或通过TD PCR摸索合适的反应条件。
2)、出现非特异性扩增带a)、引物设计不够优化：引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。
b)、模板不纯：模板被污染，需重新制备模板。
c)、试验条件不够优化：如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度、降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数；另外，可降低Mg2+及酶的浓度。
3)、条带弥散或拖尾a)、模板降解或过量：可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板，对于简单模板(例如质粒、λDNA)，每50ul反应使用1pg-10ng DNA；对于复杂模板(例如基因组、cDNA)，每50ul反应使用1ng-1ug DNA。
b)、酶量加太多：如Vazyme（诺唯赞生物）的高保真系列：50ul反应体系加1U，Taq系列：50ul体系加2U。
4)、条带很暗a)、增加模板量，提高循环数。
b)、多扩几管，胶回收浓缩。
5)、产物有错配a)、检查原始模板是否原本就是突变或错配的。
b)、少量序列存在非严谨序列，有相似重组序列，导致重组错位。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
PCR常见问题及解决方案
PCR常见问题及解决方案问题可能原因解决方法无产物或产量低模板浓度偏低或偏高电泳检测模板浓度,调整模板用量模板降解重新制备;基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存模板中含有抑制反应的杂质纯化模板引物浓度不足调整引物浓度,特别是针对长片段PCR引物存在二级结构重新设计引物,避免二级结构;优化退火温度引物降解引物应高浓度小量分装,-20℃保存,避免反复冻融Mg2+浓度偏低适当提高Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP降解-20℃保存,小量分装,避免反复冻融酶纯度低,扩增效率差选用高质量DNA聚合酶酶量不足适当增加酶量用酶不当针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)缓冲液失效更换缓冲液或使用预混PCR反应体系模板变性不充分适当延长变性时间;对高GC或复杂结构模板,提高起始变性温度至98℃退火温度偏高降低退火温度,应比引物Tm低至少5℃ 延伸时间不足增加延伸时间,特别是针对长片段PCR 循环数目不够增加循环数PCR管污染质量可靠的PCR管通常不需灭菌,否则应先高温高压灭菌处理;用过的PCR管不可清洗后重复使用PCR仪故障检查程序和模块温度其他使用PCR增强剂非特异产物过多,引物二聚体拖尾严重体系污染设计对照实验寻找污染源,操作时应注意避免交叉污染引物浓度过高适当减少引物浓度引物序列特异性差重新设计引物Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP浓度过高降低dNTP浓度酶量过多减少酶量,以0.5 U间隔递减退火温度过低提高退火温度延伸时间过短增加延伸时间,以1 min间隔递增循环次数过多减少循环次数模板结构过于复杂或目标片段过长特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南);使用PCR增强剂其他HotStart PCRTouchDown PCR巢式PCR引物3’末端存在互补序列重新设计引物引物浓度过高降低引物浓度模板浓度过低提高模板浓度退火温度不合适优化退火温度循环次数过多减少循环次数其他HotStart PCR引物浓度过高调整引物浓度引物序列特异性差或模板上存在同源序列重新设计引物模板降解重新制备模板模板浓度过高降低模板浓度dNTP浓度过高减少dNTP用量Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度酶量过多或质量差减少酶量,以0.5 U间隔递减;更换质量可靠的酶变性温度过低提高变性温度,以0.5℃递增退火温度过低提高退火温度延伸时间过长缩短延伸时间循环次数过多减少循环次数,以2个循环间隔递减体系污染设计对照实验,消除污染源其他HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR假阳性目标片段与非特异扩增片段间存在同源性设计阴性对照,确认为引物问题后重新设计引物体系污染设计阴性对照判断是否有污染,去除污染源。
PCR常见问题分析及对策
一、PCR反应的关键环节：①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量；④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
（1）模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
（5）反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50u l，或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
（6）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
PCR常见问题分析及解决策略
Mg 2＋浓度
•过低无扩增产物
•浓度适当
dNTPs
•避免反复冻融
•pH值适当 •避免污染
dH2O
如何选择最合适的DNA聚合酶
Taq酶 PCR用耐热 DNA聚合酶
pfu酶
Hotstart Taq酶 Taq plus 混合酶 Long Taq Taq platinum
PCR常见问题、 原因分析及其对策
PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略 定量PCR常见问题 临床PCR检测的常见问题
PCR标准反应体系
• DNA模板
• 引物
• 反应缓冲液 • Mg 2＋浓度 • dNTPs • dH2O • 耐热聚合酶
反应体系对PCR扩增的影响
荧光定量PCR常见问题
溶解曲线不止一个主峰：
引物设计不佳：设计特异性引物； 引物浓度不适：降低引物浓度； 退火温度低：调整退火温度；
镁离子浓度过高：降低镁离子浓度；
模板中有基因组污染：注意提取过程； 耗材仪器不匹配； 反应体系污染等：设置阳性阴性对照。
荧光定量PCR常见问题
扩增效率低：
如何选择最合适的DNA聚合酶 -----根据PCR实验需求
特异性-----基因组扩增、RT-PCR
保真性-----基因筛选、测序、克隆 长片段扩增-----构建基因图谱、测序等 扩增效率-----复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） PCR试剂盒-----复杂模板扩增、大规模基因检测
PCR常见问题之一-----无扩增产物
PCR常见问题之四-----假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原 因
靶序列或扩增产物的交叉污染
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AceTaq
图1. 模板适应性评价。以10 ng人胎盘总RNA进 行逆转录。将所得cDNA的1/10作为模板，分别 用Taq和AceTaqTM扩增EGFR,IFN8R,IL-8, ILGF-1, p53基因。35个循环后，取1/4 PCR产物 进行电泳。可以看出，对于中等拷贝数的IFN8R, IL-8和p53基因，热启动的AceTaqTM可极大提高 特异性和产量；对于低拷贝的EGFR和ILGF-1基 因，只有用AceTaqTM才能实现扩增。M:DNA Marker.
InnoVation in enzyme technology
September 2013 , Nan Jing
PCR技术原理及产品简介
Xu Xiaoyu, © 2013 Vazyme Biotech Co., Ltd
➢PCR原理 ➢PCR酶分类 ➢PCR酶性能 ➢反应体系与条件的优化 ➢特殊要求的PCR ➢常见问题与对策
➢离子强度（KCl , (NH4)2SO4等） 中和DNA所带电荷
➢ NH4+和K+阳离子存在于PCR缓冲液中，加强了引物的特异 性退火。
关键组分：Mg2+
➢Mg2+ 酶工作所必需的离子 与dNTPS和模板螯合在一起，成为DNA聚合酶识别的底物
➢Mg2+升高：提升扩增量，产生非特异性扩增，突变几率增加 Mg2+降低：降低扩增量，特异性增强，突变少
➢一定比例A型聚合酶与B型聚合酶的混合物 （或用具有更高核酸外切酶活性的蛋白取代B型聚合酶） ➢高扩增产量 ➢高合成长度 ➢保真性介于二者之间（ 3’5’ 外切酶活性）
A型酶
B型酶
扩增效率
高
低
合成长度
较短（<5kb） ？
保真性
差
好
5’→3’外切酶活性 有
无
3’→5’外切酶活性 无
有
产物3’末端
3’-A
平末端
反应条件
宽泛
苛刻
复合酶 高 长 介于A、B之间 有 有 3’-A 宽泛
PCR酶性能
➢PCR酶性能
扩增效率 保真性 特异性
扩增效率
为什么世界上有如此多的PCR酶？ ——实验表明， PCR酶对于反应具有偏好性。
仅以两种酶为例说明
10% 60%
All
I
I&II II
10% 20%
ห้องสมุดไป่ตู้真性
检验标准：突变率
随着Mg2+浓度的提高，产物特异性逐渐降低
➢某些酶配套有GC Buffer，针对高GC含量或复杂模板 ➢DMSO、甜菜碱、海藻糖……等增强剂 ➢辅助解链，稳定单链结构，促进合成 ➢复合增强剂：几种增强剂按特定比例的混合物，与单一增 强剂相比，有更强的促进能力、更广泛的适用性
➢PCR Enhancer
Lane 2: 5 kb
Lane 3: 8 kb
Lane 4: 10 kb
Lane 5: 12 kb
Lane 6: 15 kb
特异性 ——热启动酶
热启动酶：常温下酶活受限，需加热步骤才能释放酶活。
酶活
72℃
温度
不同热启动方法比较
化学封闭法
抗体封闭法
需要预加热（5-10 min） 利用Taq抗体（来源于哺 步骤，严谨性更高。 乳动物），有残留DNA污
dNTPs：浓度与纯度
➢作为原料，对反应有至关重要的影响 •影响产量 •影响特异性 •影响保真性
➢选择可靠的dNTPs：浓度准确，高纯度
不同公司dNTPs的比较
图A
图B
2~5泳道为不同公司dNTPs扩增效果比较
图C
上下两图为两个公司dNTPs 扩增效果的比较
反应缓冲液
➢pH值 提供酶的最佳工作环境 pH升高，扩增量提升，但突变率也会有所上升 pH降低，扩增量下降，保真性提升
图2. 灵敏度评价。对于每组，Lane1, DNA Marker; Lane 2-8, 640 pg-10 pg人基因组DNA 2倍稀释梯度 ；Lane9, NTC (No Template Control). AceTaqTM可 从10 pg的人基因组DNA中扩增出dystrophin基因， 相当于3个拷贝。
对Pfu酶速度的改进——快速高保真酶
速度
保真性
提升速度=牺牲保真性？No!
Phanta Super-fidelity DNA Polymerase
➢对Pfu酶进行基因工程改造，大幅提高扩增效率
Taq Pfu Phanta
快速与高保真
扩增速度 1 kb/min 0.5 kb/min 2~4 kb/min
反应体系与条件的优化
PCR体系
模板，引物
SuperMix
（简易、操作污 染几率小）
dNTPs
酶
反应缓冲液 (pH值，离子强度， Mg2+)
Mg2+ PCR酶
PCR体系中各组分相互作用
合成链 模板链 PPi
dNTPs
模板：品质高
模板核酸的纯度，也是PCR成败的关键环节之一。这些杂质经常存 在于传统方法制备获得的模板中，详情见下表：
保真性——不同聚合酶保真性比较
DNA Polymerase
错配率 (bp/cycle)
Taq Pfu Phanta LAmp
8x10-6 1.3x10-6 1.5x10-7 4x10-6
30 cycles (error/bp)
2.4x10-4 3.9x10-5 4.5x10-7 1.2x10-4
30 cycles (error/4 kb)
随着Mg2+浓度的提高，扩增产量随之提升
M1 2345
人cDNA模板, GAPDH 0.5 kb Taq 扩增 Lane M：Trans 2K DNA Marker Lane 1：Mg2+ 0 mM Lane 2：Mg2+ 1.0mM Lane 3：Mg2+ 2.0 mM Lane 4：Mg2+ 3.0 mM Lane 5：Mg2+ 4.0 mM
Janice Cline, Jeffery C. Braman and Holly H. Hogrefe*. (1996) PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Research. 24, 3546–3551
PCR原理
PCR：Polymerase Chain Reaction——聚合酶链式反应 核心：耐热DNA聚合酶
PCR酶分类
A型、B型DNA聚合酶三维结构
A型、B型DNA聚合酶三维结构 3’-exo的位置不同
A型聚合酶（Taq 酶系列）
➢高扩增产量（≤5 kb） ➢较低的保真性 ➢3’-A ➢具有5’ -3’外切酶活性，用于探针法的荧光定量 ➢宽泛的反应条件 ➢对抑制物（盐、血、酚等）敏感 ➢难以扩增复杂模板（高GC、二级结构等）
增强剂与Mg2+对PCR的影响
模板 GC 含量72%
图1. 以质粒为模板，primer pair 1或primer pair 2为引物，用Taq酶扩增大小为690 bp,GC含量为 72%的片段。只有加入PCR Enhancer才能扩增 出如箭头所指的目的片段。M, DNA Marker。
保真性 1× 18× 52×
扩增速度：15~30 sec/kb ➢与模板和片段长度有关。 ➢15 sec/kb可满足大多数反应，对某些反应，为得到较 高扩增量与特异性，可延至30 sec/kb ➢最快可达到传统Pfu酶的 8 倍
Pfu与Phanta酶扩增速度比较
Template length
10kb
0.96 0.16 0.015 0.48
克隆数 (无错配)
4 out of 100 84 out of 100 98 out of 100 52 out of 100
* PCR条件对错配率有明显的影响（酶、dNTP以及镁离子浓度，等等）。
B型聚合酶与复合酶
优点 缺点
B型聚合酶（Pfu 酶）
高保真性 产物为平末端 （应用于点突变）
突变率与所选的基因、PCR条件有密切关系 蓝白斑显色法检验LacZa基因突变率
Stanislaw K. Jozwiakowski and Bernard A. Connolly*. (2009) Plasmid-based lacZa assay for DNA polymerase fidelity: application to archaeal family-B DNA polymerase. Nucleic Acids Research.
图1. 使用PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase 以λ DNA为模板扩增长度分别为200 bp、600 bp、 800 bp、1 kb、1.2 kb、2.0 kb的目标片段，延伸 时间设置为1秒。所有片段均可实现高效扩增。
图2. 使用PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase 以λ DNA为模板扩增长度分别为5 kb、8 kb、10 kb、12 kb、15 kb的目标片段，延伸时间设置为3 分钟。所有片段均可实现高效扩增。
对复合酶的改进——保真性的提升
➢复合酶高保真性的来源： 少量Pfu 酶的核酸外切酶活性
➢改造思路： 利用具有更高核酸外切酶活性的蛋白取代Pfu 酶 与聚合能力低、对dUTP敏感的Pfu 酶相比，此类复合
酶由Taq 酶完成全部聚合，合成效率更高。
➢产品：
Lamp DNA Polymerase
图1. 以100 ng人基因组DNA为模板，用LAmpTM DNA Polymerase 扩增长度为5-15 kb的片段。程序为： 94℃ 30 s 94℃ 10 s 68℃ 30 s/kb 68℃ 7 min Lane 1: 1 kb ladder