qPCR实验操作流程

Q—PCR实验流程
一、①实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开
１５-20分钟。

②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RＮA抽提需带口罩.③取EP管/枪头时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用。

取完EP管/枪头后,袋子及时封好.④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台,移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面．⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。

二、总RNA抽提
１）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后,用1mｌ枪将PＢＳ吸干净,加入1ｍl Triｚol(Inｖｉｔｒogen)溶液,吹打混匀,并吸至１.５ml ＲＮasｅｆree EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；
组织样品用液氮充分研磨，加入1mｌTriｚoｌ(Inｖｉtrogen）溶液,混匀,室温放置5mｉn使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)
2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）
3)４℃下,１4，000g离心15min，可见分为三层，RNＡ在上层水相,移至另一个新的RNase fｒee EP管；（用2０—200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）
4）沉淀RNA:加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6－8次）(不应用振荡器混匀),室温静置10miｎ；
5）4℃下，14,000g离心１0ｍiｎ,收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀,应将ＥＰ管放置在-８0度冰箱过夜，继续在４℃下，14,０0０g离心10miｎ，收集RNA沉淀),去上清;
6）用75%乙醇洗涤两次(１2,0０0g离心5min）(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀）,超净台风干;沉淀不能过干
或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。

7）视沉淀量加入适量DEPＣ水(至少１5ul）溶解沉淀。

三、去基因组
使用ＲNasｅ—free的DNａsｅІ(Ｐromega),按以下体系配置反应液,3７℃消化30mｉｎ,65℃灭活10mｉn。

RNA
DNase І
１０xbuffｅr H２Ｏ（ＲNasｅｆrｅｅ）RNasiｎ
3０
20
１0
39.5
0。

5
µl
µl
µl
µl
µl
总体积10０µl
然后按以下步骤操作:
1) 加入等体积的苯酚/氯仿,上下颠倒混匀,室温放置５miｎ，后１４,00
０ｒpm，离心15min,取上清。

2）加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,０00rｐｍ,离心1５min,取上清．
3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6—８次)，—2０℃静置15m ｉn；
4）４℃下，14,００0ｇ离心15ｍin,收集RNA沉淀,去上清;
5）用75%乙醇洗涤两次(１2，000g离心5mｉn)，超净台风干；
6）加入适量DEＰC水(至少15ul)溶解沉淀。

四、总RＮＡ纯度和完整性检测
1）纯度检测：取１μl RNA样品５０倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD 值,OD2
６０/ＯＤ２８0的比值大于1.8，说明制备的ＲNＡ较纯，无蛋白质污染。

2）总ＲＮＡ完整性检测:取RＮＡ样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min,EB 染色1０min,用凝胶成像系统观察并拍照,总ＲＮA的5s rRＮA，１8ｓrRNA和2８ｓrRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。

五、逆转录 １. mRNA:
1) 在RNase ｆree 的PC Ｒ管中配置下列溶液.
2) 将上述溶液吹打均匀,置８5℃保温5min ，使R ＮA 变性。

随后立即冰上致冷，
以防止RNA 复性;
3) 在该PC Ｒ管中加入下列试剂（Pro ｍe ｇa ）
ｏl ｉgo(ｄT ）
R ａｎdom p ｒi ｍer 10mM dNTP RNase inhibitor 5 x buf ｆer M-ML Ｖ 0。

5
0.5 2.0 0。

5 4。

0
0.5 µl µｌ µl µｌ µl µl 总体积
８。

０
µl
4) 将上述20μｌ反应溶液３0℃保温1０min; 5) 42℃保温５0m ｉn; 6) 85℃保温１0min; 7) -２０℃保存。

2。

micro ＲNA:
使用茎环逆转录法,原理如下图：
Total RNA H 2O 1。

0 µｇ µｌ 总体积
12
µl
1） 在去RNase 的PC Ｒ管中配置以下溶液。

2）将上述溶液混匀，85℃孵育５ｍｉｎ,以打开ＲNA 二级结构。

随后立即置于
冰上,以防止RNA 复性再次恢复二级结构; 3） 在另一去ＲN ａse 的ＰC Ｒ管中配置以下溶液：
10mMdNT Ｐ (ｐrome ｇａ) ＲNa ｓe ｉnhibit ｏｒ （promega) U6逆转录引物 5xbuffer
M-MLV （p ｒomega ） 2。

0 ０.5 ０。

5 4.0 ０.5 µl µl µl µl µｌ 总体积
7.5
µｌ
4） 将3)溶液加入到１）溶液中,混匀后３0℃保温10m ｉn; 5） 42℃孵育５0ｍin ；
6） ８5℃孵育１0min 灭活逆转录酶．
四、定量PCR 检测 １。

引物测试:
tot ａl ＲＮA X 个miR 逆转录引物 Ｈ2O 1。

0 ０。

５＊X
µg µl
总体积
12.５
µl
根据mRNＡ设计的引物正式实验前需进行qPＣＲ测试其特异性和扩增效率,具体反应体系和反应条件如正式实验,每对引物需做模板水对照.
得到结果后,首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为:单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰.若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好,则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ｃt值小、扩增效率高的引物进行正式实验。

２.确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。

(1）一个样品的加样尽可能安排在同一行(2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上,则需把三次重复中的实验分开,但同一次重复的实验不能分开两板
3．正式实验:
体系配制:
H2Ｏ4ul
ＳYＢR GrｅeｎPＣＲMａster Mｉｘ10ul （TＯYOBO)(使用前需振荡均匀)
上游引物0.5ul (10uＭ)
下游引物0．５ｕl (10uM)
总体积15ul
计算好实验中需用多少份体系,则按具体量配置。

体系分装会有损失，一般多配0.5份—-1份体系。

总的体系配好后,在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀,然后15uｌ每管分装至8连管中。

３.ｃDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度,一般为1:２0稀释,如遇到基因表达低的样品,则适当降低稀释比例至1:10或1：5。

cＤNA按一定顺序排好后,即可加至刚配好的反应体系中。

加样完毕,盖好八连管盖,并在八连管盖最上沿的边上标记好1—１2的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上,八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域,且保证每孔均盖紧,否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。

）
4．把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。

五.上机：
５.1 先开电脑,进入Windｏws 界面。

接着打开PCＲ仪电源开关。

5。

2 打开7500软件，选择“新建”,在“Tｅｍplate”下拉菜单中选择“60”
或“65”(普通基因检测为“60”,MicroRＮA检测为“65”)
5。

3打开样品架，放入八连管,关上样品架,并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位。

5.4 点击Fiｌe菜单中Sａve,输入要保存结果的文件名，命名为日期-上机时间-客户名字简写，如1００830—100８—WL表示8月3０日10点０8分魏立的实验。

5.5 点击Ｓtａrt键，开始运行程序。

5。

6 程序运行完毕后,取出样品架上的八连管,按顺序关闭AＢＩＰRＩSＭ7５0０SＤＳ软件、PCＲ仪电源开关。

5。

7 在750０软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件。

反应完成后,八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名,客户的名字。

（同一个客户的三次重复实验,则只需保存其中一次重复的反应管即可，其余可丢弃)。