实验七 亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴定目的蛋白质(GST、SDS-PAGE
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13
二、装GSH-Sepharose 4B柱
1. 清洗和装好层析柱，封闭出口； 2. 加入2 mL PBS； 3. 取1-2 mL GSH-Sepharose 4B，加入柱子中； 4. 打开柱子出口，使PBS缓慢流出。
注意：始终保持柱内的液面高于 GSH-Sepharose 4B
14
三、纯化目的蛋白
试剂名称 ddH2O
30% Acr-Bis（29:1） 1.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）
10%SDS TEMED 10%AP（最后加） 总体积
加液量 3.4 mL 0.86mL 0.62mL 50 uL 20 uL 50 uL 5.0 mL
29
实验步骤
5. 将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液， 轻轻拔掉梳子；
蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。 在15-200 KD之间，蛋白质的迁移率和分子量
的对数呈线性关系： logMW=K-bm
22
23
连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓 度相同。（电荷效应、分子筛效应）
不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓 度及电位梯度的不连续性。
（电荷效应、分子筛效应、浓缩效应）
4
原亲 理和
层 析
5
6
7
GSH-Sepharose 4B
8
GSH- Sepharose 4B
9
GSH-Sepharose 4B
10
亲和层析流程
11
第一部分 实验步骤
12
一、细胞破碎
3600 mL诱导的菌液，离心分装到12只50 mL 离心管，-20℃保存；（每个班用2管）
每管加30 mL PBS缓冲液，混匀； 超声3S，暂停5S，持续15 min； 4℃，10000 rpm，离心10 min； 取50 uL上清，作为纯化前的样品； 每组取3-5 mL上清液，上柱纯化。
蛋白质区带中心至分离上沿距离
蛋白标准的分子量对数作为纵坐标，相对迁移 率作横坐标，做标准曲线。根据目的蛋白的迁移率 以及标准曲线，可以计算相对分子量。
34
SDS-PAGE试剂
1. 30%（W/V）凝胶液：丙烯酰胺（Acr） 29.0 g ，亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 1.0 g，加水到 100 mL。
17
亲和层析试剂
PBS（pH 7.4）: NaCl（58.5）40 g；KCl（74.5）1.0 g； KH2PO4（136.09）1.2 g； Na2HPO4·12H2O （358.14）18.1 g； 加水定容到5000 mL。
18
亲和层析试剂
50 mM Tris-HCl（pH 8.0）: Tris（121.14）6.055 g，溶于900 mL水，用 HCl调pH到8.0，用水定容至1000 mL。
实验七 亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴
定目的蛋白质
1
实验目的
掌握GST亲和层析纯化目的蛋白的原理 和实验方法（第一部分）
掌握SDS-PAGE检测目的蛋白原理和方 法（第二部分）
2
第一部分 GST亲和层析纯化目的蛋白
3
亲和层析原理
生物大分子与配体特异非共价结合。 酶-底物或底物类似物（竞争性抑制剂） 抗体-抗原 激素-受体 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 核酸-互补序列（Oligo-dT）
10. 脱色液：50 mL甲醇，75 mL冰乙酸，875 mL 水。
38
26
实验步骤
1. 洗净玻璃板，吹干，安装制胶器； 2. 制作12%分离胶。按下表顺序加试剂，混匀，加入 玻璃板间，加液高度与电泳槽中的横杠上沿等高； 3. 用1 mL蒸馏水封住液面，室温30 min，分离胶与水 之间出现分界线，倒掉水层，用滤纸吸干残余的水； 4. 配制5%浓缩胶，混匀，加入玻璃板间，插入梳子， 静置30 min；
1. 用5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 2. 将混合蛋白质溶液2-3 mL加到柱子中。 3. 用5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4. 加入1.0 mL 洗脱液。 5. 用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集 0.2 mL（3-4
滴），共收集5管。 6. 用5 mL PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7. SDS-PAGE检测第2和3管中的目的蛋白。
15
四、SDS-PAGE样品制备
1号：过柱前的蛋白溶液80 uL 2号：收集的蛋白溶液（2号管）80 uL 3号：收集的蛋白溶液（3号管）80 uL
1-3号分别加入20 uL 5×上样缓冲液， 混匀后在沸水中加热3 min。
16
1 2 3M 1 2 3M
样品加30 uL Marker加10 uL
洗脱液: 还原型谷胱甘肽（307.32） 0.15366 g，溶于 50 mL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。
19
第二部分 SDS-PAGE检测目的蛋白质
20
实验目的
掌握SDS-PAGE检测蛋白原理和方法 掌握垂直板电泳的实验方法
21
实验原理
蛋白质与SDS按1:1.4比例形成复合物，消除 了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
37
8. 上样缓冲液（5×）：1.0 moL Tris-HCl（pH 6.8）40 mL，甘油40 mL，巯基乙醇20 mL， SDS 8.0 g，溴酚蓝0.005 g，体积100 mL。
9. 染色液：考马斯亮蓝R-250 1.0 g，250 mL甲醇 （乙醇），80 mL冰乙酸，670 mL水 。
24
浓缩效应
1. 凝胶孔径的不连续性（2种孔径） 2. 缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓 冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质 分子的迁移率比Cl- 低，比Gly高。
25
浓缩效应
3. 电位梯度不连续性：快离子（ Cl- ）后面形 成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低 电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间 的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的 界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小 的中间层。
2. 分离胶缓冲液（pH8.8，1.0 mol/L Tris-HCl）： 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 12.1 g，加80 mL 蒸馏水，用1.0 mol/L HCl调节pH到8.8，用蒸 馏水稀释到100 mL。
35
3. 浓缩胶缓冲液（1.0 mol/L Tris-HCl，pH 6.8） Tris 12.1 g，加60 mL蒸馏水，用1.0 mol/L HCl 调节pH到6.8，加蒸馏水到100 mL。
4-5 min，重复2-3次； 10. 观察胶中的蛋白质条带。
31
纯化前 纯化后 Marker
32
实验试剂
蛋白质分子量标准 兔磷酸化酶B 97400 牛血清白蛋白 66200 兔肌动蛋白 43000 牛碳酸酐酶 31000 胰蛋白酶抑制剂 20100 鸡蛋清溶菌酶 14400
33
实验结果
绘制标准曲线：log MW = K - bm
6. 点样：每个样点30 uL，Marker点15 uL； 7. 电泳：100 V，约20 min，样品进入分离胶后，将电
压调到130 V，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，停 止电泳；
30
实验步骤
8. 拆开玻璃板，切除浓缩胶，将分离胶放入塑 料盒内，加入染色液，振荡30 min； 9. 回收染色液，加水清洗，用微波炉高火煮
27
12%分离胶
试剂名称
ddH2O 30% Acr-Bis（29:1） 1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）
10% SDS TEMED（加速剂） 10% AP（催化剂，最后加）
总体积
加液量
2.5 mL 3.0 mL 2.0 mL 75 uL 10 uL 75 uL 7.5 mL
28
5%浓缩胶
4. 10 %（W/V）SDS
5. 10 %（W/V）过硫酸铵（现用现配）
36
6. 10×电极缓冲液（pH 8.3）：Tris 30.3 g，Gly 144.2 g，SDS 10 g，加水到1000 mL。
（用时稀释10倍）
7. 蛋白质标准溶液：低分子量蛋白质标准，加 200 uL水溶解，加50 uL上样缓冲液。
二、装GSH-Sepharose 4B柱
1. 清洗和装好层析柱，封闭出口； 2. 加入2 mL PBS； 3. 取1-2 mL GSH-Sepharose 4B，加入柱子中； 4. 打开柱子出口，使PBS缓慢流出。
注意：始终保持柱内的液面高于 GSH-Sepharose 4B
14
三、纯化目的蛋白
试剂名称 ddH2O
30% Acr-Bis（29:1） 1.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）
10%SDS TEMED 10%AP（最后加） 总体积
加液量 3.4 mL 0.86mL 0.62mL 50 uL 20 uL 50 uL 5.0 mL
29
实验步骤
5. 将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液， 轻轻拔掉梳子；
蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。 在15-200 KD之间，蛋白质的迁移率和分子量
的对数呈线性关系： logMW=K-bm
22
23
连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓 度相同。（电荷效应、分子筛效应）
不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓 度及电位梯度的不连续性。
（电荷效应、分子筛效应、浓缩效应）
4
原亲 理和
层 析
5
6
7
GSH-Sepharose 4B
8
GSH- Sepharose 4B
9
GSH-Sepharose 4B
10
亲和层析流程
11
第一部分 实验步骤
12
一、细胞破碎
3600 mL诱导的菌液，离心分装到12只50 mL 离心管，-20℃保存；（每个班用2管）
每管加30 mL PBS缓冲液，混匀； 超声3S，暂停5S，持续15 min； 4℃，10000 rpm，离心10 min； 取50 uL上清，作为纯化前的样品； 每组取3-5 mL上清液，上柱纯化。
蛋白质区带中心至分离上沿距离
蛋白标准的分子量对数作为纵坐标，相对迁移 率作横坐标，做标准曲线。根据目的蛋白的迁移率 以及标准曲线，可以计算相对分子量。
34
SDS-PAGE试剂
1. 30%（W/V）凝胶液：丙烯酰胺（Acr） 29.0 g ，亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 1.0 g，加水到 100 mL。
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亲和层析试剂
PBS（pH 7.4）: NaCl（58.5）40 g；KCl（74.5）1.0 g； KH2PO4（136.09）1.2 g； Na2HPO4·12H2O （358.14）18.1 g； 加水定容到5000 mL。
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亲和层析试剂
50 mM Tris-HCl（pH 8.0）: Tris（121.14）6.055 g，溶于900 mL水，用 HCl调pH到8.0，用水定容至1000 mL。
实验七 亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴
定目的蛋白质
1
实验目的
掌握GST亲和层析纯化目的蛋白的原理 和实验方法（第一部分）
掌握SDS-PAGE检测目的蛋白原理和方 法（第二部分）
2
第一部分 GST亲和层析纯化目的蛋白
3
亲和层析原理
生物大分子与配体特异非共价结合。 酶-底物或底物类似物（竞争性抑制剂） 抗体-抗原 激素-受体 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 核酸-互补序列（Oligo-dT）
10. 脱色液：50 mL甲醇，75 mL冰乙酸，875 mL 水。
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26
实验步骤
1. 洗净玻璃板，吹干，安装制胶器； 2. 制作12%分离胶。按下表顺序加试剂，混匀，加入 玻璃板间，加液高度与电泳槽中的横杠上沿等高； 3. 用1 mL蒸馏水封住液面，室温30 min，分离胶与水 之间出现分界线，倒掉水层，用滤纸吸干残余的水； 4. 配制5%浓缩胶，混匀，加入玻璃板间，插入梳子， 静置30 min；
1. 用5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 2. 将混合蛋白质溶液2-3 mL加到柱子中。 3. 用5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4. 加入1.0 mL 洗脱液。 5. 用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集 0.2 mL（3-4
滴），共收集5管。 6. 用5 mL PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7. SDS-PAGE检测第2和3管中的目的蛋白。
15
四、SDS-PAGE样品制备
1号：过柱前的蛋白溶液80 uL 2号：收集的蛋白溶液（2号管）80 uL 3号：收集的蛋白溶液（3号管）80 uL
1-3号分别加入20 uL 5×上样缓冲液， 混匀后在沸水中加热3 min。
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1 2 3M 1 2 3M
样品加30 uL Marker加10 uL
洗脱液: 还原型谷胱甘肽（307.32） 0.15366 g，溶于 50 mL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。
19
第二部分 SDS-PAGE检测目的蛋白质
20
实验目的
掌握SDS-PAGE检测蛋白原理和方法 掌握垂直板电泳的实验方法
21
实验原理
蛋白质与SDS按1:1.4比例形成复合物，消除 了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。
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8. 上样缓冲液（5×）：1.0 moL Tris-HCl（pH 6.8）40 mL，甘油40 mL，巯基乙醇20 mL， SDS 8.0 g，溴酚蓝0.005 g，体积100 mL。
9. 染色液：考马斯亮蓝R-250 1.0 g，250 mL甲醇 （乙醇），80 mL冰乙酸，670 mL水 。
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浓缩效应
1. 凝胶孔径的不连续性（2种孔径） 2. 缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓 冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质 分子的迁移率比Cl- 低，比Gly高。
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浓缩效应
3. 电位梯度不连续性：快离子（ Cl- ）后面形 成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低 电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间 的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的 界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小 的中间层。
2. 分离胶缓冲液（pH8.8，1.0 mol/L Tris-HCl）： 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 12.1 g，加80 mL 蒸馏水，用1.0 mol/L HCl调节pH到8.8，用蒸 馏水稀释到100 mL。
35
3. 浓缩胶缓冲液（1.0 mol/L Tris-HCl，pH 6.8） Tris 12.1 g，加60 mL蒸馏水，用1.0 mol/L HCl 调节pH到6.8，加蒸馏水到100 mL。
4-5 min，重复2-3次； 10. 观察胶中的蛋白质条带。
31
纯化前 纯化后 Marker
32
实验试剂
蛋白质分子量标准 兔磷酸化酶B 97400 牛血清白蛋白 66200 兔肌动蛋白 43000 牛碳酸酐酶 31000 胰蛋白酶抑制剂 20100 鸡蛋清溶菌酶 14400
33
实验结果
绘制标准曲线：log MW = K - bm
6. 点样：每个样点30 uL，Marker点15 uL； 7. 电泳：100 V，约20 min，样品进入分离胶后，将电
压调到130 V，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，停 止电泳；
30
实验步骤
8. 拆开玻璃板，切除浓缩胶，将分离胶放入塑 料盒内，加入染色液，振荡30 min； 9. 回收染色液，加水清洗，用微波炉高火煮
27
12%分离胶
试剂名称
ddH2O 30% Acr-Bis（29:1） 1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）
10% SDS TEMED（加速剂） 10% AP（催化剂，最后加）
总体积
加液量
2.5 mL 3.0 mL 2.0 mL 75 uL 10 uL 75 uL 7.5 mL
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5%浓缩胶
4. 10 %（W/V）SDS
5. 10 %（W/V）过硫酸铵（现用现配）
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6. 10×电极缓冲液（pH 8.3）：Tris 30.3 g，Gly 144.2 g，SDS 10 g，加水到1000 mL。
（用时稀释10倍）
7. 蛋白质标准溶液：低分子量蛋白质标准，加 200 uL水溶解，加50 uL上样缓冲液。