Western Blot使用技术手册

生物医药基地western blot技术手册
1.western blot 主要试剂的配方
1.1 5×电泳缓冲液配方(1L)
注意事项：
a.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。

b.配制好的溶液放于4度冰箱保存，使用时用纯水稀释至1×使用。

1.2 1×转膜液配方（1L）
注意事项：
a.加入适量的纯水，用磁力转子将各组分溶解后加入甲醇溶液，最后
用纯水定容至1L（甲醇气味大，通风厨内配制，并注意戴口罩）。

b.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。

1.3 10×TBS配方（1L）
注意事项：
a.加入适量的纯水溶解各组分后，使用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调节溶液的PH至7.6（一般溶解后溶液是偏碱的，所以选用浓盐酸调节PH至7.6即可）。

b.使用PH计调节溶液的PH前，要按照说明书校准PH计。

c.PH调节至7.6后，用纯水定容至1L，使用时稀释10倍至1×使用。

d.配制TBST时，在1×TBS中按照1:1000的比例加入吐温20充分混匀即可。

1.4 30%丙烯酰胺单体储存液配方（100ml）
注意事项：
a. 将各组分溶于总体积为60ml的纯水中，加热至37℃完全溶解，用纯水定容至100ml。

b. 用装0.45µm膜的滤器过滤，置于棕色瓶中保存于4℃冰箱保存。

c. 丙烯酰胺有神经毒性，操作时戴手套，并注意不要造成实验台面等的污染。

1.5 上液（1M Tris-HCl PH=6.8）配方（50ml）
注意事项：用浓盐酸调节PH至6.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。

1.6下液（1M Tris-HCl, pH8.8 ）（50ml）
注意事项：用浓盐酸调节PH至8.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。

2. Western Blot 主要流程
2.1蛋白样品的提取
2.1.1常用裂解液及其特点
2.1.2 医药基地常用蛋白质提取方法
⑴RIPA强裂解法：
a. 取适量胰酶消化细胞（针对对贴壁细胞，悬浮细胞可省略此步），收取细胞，PBS洗两遍，600g离心5min，尽量去除PBS，向细胞沉淀中加入适量的预加了蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA强裂解液（80ul ——200ul不等，根据自己细胞量的多少定）。

b. 冰上裂解40min，每5min剧烈涡旋一次。

c. 充分裂解后，14000rpm，4℃离心15min，将上清转至另一预冷的EP管中（不要吸到管底的沉淀）。

注意事项：
a.整个过程尽量在冰上操作，因为蛋白在常温降解速度很快，而在
冰上则能显著的减慢这一过程。

b.PMSF有毒，注意戴手套，并注意不要造成实验台面等的污染。

⑵SDS煮沸法（此方法对Caspase家族切割条带具有特效）：
a. 收取细胞，PBS洗两遍，600g离心5min，尽量去除PBS。

b. 向细胞沉淀中加入适量的预加了蛋白酶抑制剂PMSF的SDS裂解液（80ul—200ul不等，根据自己细胞量的多少定）。

c. 将EP管放在加热器上95-100℃加热20min以上，加热至样品中的核酸粘稠物(细胞内核酸)完全溶解为止。

d. 充分裂解后，14000rpm，4℃离心15min，将上清转至另一预冷的EP管中（不要吸到管底的沉淀）。

注意事项：
a. 由于加热的温度很高为95℃，煮沸的全过程中，不要离开蛋白样品，防止EP管炸开而损失蛋白样品，甚至蛋白样品被蒸干。

具体技巧与方法：放物体压住EP管，待加热时间快结束时，停止加热，冷却到一定时间，轻轻拿开物体，轻轻拿出EP管。

b. 尽快将核酸粘稠物煮化，缩短提取蛋白时间。

具体技巧与方法：加热前适度涡旋，加热过程中用剪去尖端的枪头吹打样品。

c. 提取的蛋白样品置于-20℃保存。

⑶细胞刮法（针对贴壁细胞）
a. 倒掉培养基，PBS洗培养皿2次。

b. 吸尽残留的PBS，加入预加了PMSF的SDS裂解液50-500Ul,迅速用细胞刮将细胞刮下，并将裂解后的细胞转移到EP管中，其他步骤同SDS煮沸法。

注意事项：整个过程尽量在冰上操作以减慢蛋白的降解。

2.2蛋白样品的定量
本实验室采用BCA法测定蛋白质浓度，具体步骤：
a. 将各蛋白样品稀释20倍（根据自己蛋白样品的浓度可加大稀释倍数）至总体积为40ul或以上，以供每个样品3个复孔。

b. 将蛋白样品和蛋白标准品加入96孔板中，每孔10ul，每个样品3个复孔。

c. 配制显色液，充分混匀，加入96孔板，每孔100ul。

d. 37℃孵育30min，酶标仪检测吸光度。

注意事项：
a. 尽量将样品加在96孔板的中间位置，避免酶标仪检测时的边缘效应。

b. 加入样品和显色液的过程中尽量避免气泡的产生。

c. 选用精确度高的移液枪，尽量使用进口的枪头。

2.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制
2.3.1不同浓度胶的最佳分离范围
SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围
6%胶50-150kD
8%胶30-90kD
10%胶20-80kD
12%胶12-60kD
15%胶10-40kD
2.3.2不同浓度胶的配制
成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)
6%胶5ml 10ml 15ml 20ml 30ml 50ml
蒸馏水 2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 20.0 30%Acr-Bis(29:1) 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 10.0
1M Tris, pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0
10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.024 0.04 成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)
8%胶5ml 10ml 15ml 20ml 30ml 50ml 蒸馏水 1.7 3.3 5 6.7 10.0 16.7 30%Acr-Bis(29:1) 1.3 2.7 4.0 5.3 8.0 13.3 1M Tris, pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.018 0.03 成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)
10%胶5ml 10ml 15ml 20ml 30ml 50ml 蒸馏水 1.3 2.7 4.0 5.3 8.0 13.3 30%Acr-Bis(29:1) 1.7 3.3 5.0 6.7 10.0 16.7 1M Tris, pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02 成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)
12%胶5ml 10ml 15ml 20ml 30ml 50ml 蒸馏水 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 10.0 30%Acr-Bis(29:1) 2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 20.0 1M Tris, pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02 成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)
15%胶5ml 10ml 15ml 20ml 30ml 50ml 蒸馏水0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 5.0 30%Acr-Bis(29:1) 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 25.0 1M Tris, pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5
10%过硫酸铵0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02
按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶（也称为堆积胶、上层胶）
成分配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升)
5%胶 2 3 4 6 8 10
蒸馏水 1.4 2.1 2.7 4.1 5.5 6.8 30%Acr-Bis(29:1) 0.33 0.5 0.67 1.0 1.3 1.7
1M Tris, pH6.8 0.25 0.38 0.5 0.75 1.0 1.25 10%SDS 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 10%过硫酸铵0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 TEMED 0.002 0.003 0.004 0.006 0.008 0.01
2.4 Western Blot主要步骤
（1）样品制备（具体方法参见2.1.2）
进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin和GAPDH。

注意事项：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份浓缩目的蛋白或采用更敏感的检测方法。

（2）电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）
注意事项：
a. 胶版都是精密的玻璃器材，使用时轻拿轻放，禁止将胶板放到烘箱烘烤。

b. 电泳槽和胶槽中的电泳液要充足，可以避免跑出“笑脸”和“哭
脸”。

c. 根据实验者的样品数选择相应的泳道数，样品的两侧需加入蛋白marker，便于剪切目的蛋白条带。

剩余的泳道加入等体积的1×SDS 填充，以平衡盐离子电压，这样可以防止蛋白条带跑歪。

两侧的蛋白marker可选择不同的用量，然后根据蛋白marker的深和浅区分点样的顺序。

d. Western Blot中使用过的任何器材、试剂、仪器，全部要放归原位或恢复到使用前的状态。

（3）转膜
杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。

应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。

用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜（基地目前使用）。

NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。

根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。

因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。

通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC 膜。

大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。

PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。

但PVDF膜在使用之前必需分别用纯甲醇、纯
水、转膜液浸泡饱和5min。

蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转（基地目前使用）和半干转移。

前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。

操作步骤：
a. 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。

如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。

b. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。

c. 装配转移三明治：海绵+3层滤纸+胶+膜+3层滤纸+海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。

切记：胶放于负极面（黑色面）。

d. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，选择稳流200mA，1-2h（根据分子量的大小决定电泳时间）。

注意：应再次检查“三明治”和电极是否装配正确，电源是否接通。

e. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜
注意事项：
a. PVDF膜是比较贵重的试验用品，使用时要节约使用，根据胶的大小来裁剪PVDF膜。

b. 做“三明治”的过程中，膜与胶之间不能有气泡。

c. 活化PVDF膜要充分，若出现点点白斑，说明活化不充分，需要延长活化时间。

d. 转膜液可回收4次使用，回收次数过多影响实验结果。

e. 分子量大的蛋白需延长转膜时间，小分子量蛋白则可适当增加转膜液中甲醇的比例。

f. 转膜结束后，将膜与胶接触的一面标记为正面。

（4）免疫杂交与显色
a. 用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。

b. 置膜于25 ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。

c. 15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

d. 加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h（一抗无法回收）或4°C 过夜（一抗可回收多次），缓慢摇动。

注意事项：
a. 一抗为贵重的实验用品，使用前必读：本实验室有比较齐全和充足的抗体库，所有（或大部分）购买的抗体在基地OA系统中均有详细资料记录，首先实验者需要在OA系统中确定基地购买了目的蛋白相关的抗体，然后确定所购买的抗体的生产商以及货号，再根据这些信息登陆相应生产商的网页，详细查阅实验者即将使用一抗的用途（WB、IP、Flow、IF等）、一抗来源（便于选择合适的二抗）、目的条带的分子量大小（便于根据蛋白marker剪切目的条带）、一抗的特异性、一抗使用的稀释比例。

掌握这些资料后方能开始下一步的试验。

b. 由于WB公用平台使用者多，使用频繁，贵重实验用品消耗很大，因此一抗的使用必须是4°C孵育过夜，回收使用多次，孵育必须使用杂交袋，小PVDF膜需2-3ml抗体，大PVDF膜需3-4ml抗体，特大膜需5ml抗体。

c. 回收的一抗必须做好详细的标记（包括稀释日期、抗体名称、稀释比例、抗体来源），便于下次继续使用。

d. 一抗变质的判断：出现絮状沉淀物、两次以上无法显示出目的条带、存放5个月以上、室温放置超过1h。

e. 若一抗反复多次得不到目的条带，可以选择联系抗体公司技术部门；也可选择查阅相关文献，文献应包含相同的细胞株，相同的目的蛋白。

根据文献资料可选择文献报道公司的抗体产品，若文献选择的抗体公司与本实验室相同，而实验者在确定自身试验方法正确的情况下，得不到目的条带，可联系该公司技术部门申请退货。

（5）15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

（6）加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。

注意事项：
a. 二抗的使用也必须使用杂交袋孵育以节约抗体，可以不回收使用，用量原则与一抗相同。

b. 二抗使用的稀释比例必须严格按照说明书使用，目前实验室使用鼠二抗的稀释比例是1：3000—10000，使用兔二抗的稀释比例是1 :5000—10000，使用羊二抗的稀释比例是1 :10000以上，过低的稀释比例会造成过高的显影背景。

（7）15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。

（8）15 ml TBS洗1次。

（9）蛋白检测(显色法或发光法，按相应试剂说明操作)。

注意事项：
a. 显影液和定影液按照规章使用，切忌将二者弄混。

b. 胶片使用全过程严格避光，开灯前确保胶片盒盖好，确保胶片盒已放入黑色塑料袋，确保存放胶片的纸箱已盖好。

c. 胶片的使用一般可根据实验者PCDF膜的大小裁剪为两片使用（切记避光操作），每次层叠胶片数小于4张，一般1-2张胶片即可。

d. 根据不同目的条带荧光强度的不同，实验者需调整压片的时间，从1min—2h不等，甚至可以压片一天后再显影，但必须做到良好的避光措施。

e. 显影时间不宜过长，新的显影液2min即可，旧显影液也不要超过4min，否则背景发黑。

定影时间可稍长，一般5min以上，以确保定影的效果。

f. 显影液、定影液15天更换一次。

g. 对于磷酸化蛋白的检测，尽量选用进口的发光液（Millipore发光液）。